微型猪原主主动脉内皮细胞的隔离与培养

该方法是将内皮细胞与微型猪隔离的高效方法。细胞也可以扩大，研究异种移植中的免疫和凝固反应。技术的主要优点是，从猪体内分离出高度纯化的内皮细胞不仅简单、高效，而且在通过时更便于保存其他pAEC。

在确认麻醉猪对疼痛反射缺乏反应后，用75%的医用酒精和一剂碘洗猪腹壁三次。最后一次洗涤后，用手术刀做腹部切口，露出劣质的维纳卡瓦，并使用五毫升注射器将5000单位肝素钠注射到劣质的维纳卡瓦中。五分钟后，将导管插入腹部主动脉，并使用手术刀将隔膜插入。

在第二名调查员的帮助下，切除左心室，用骨钳切除肋骨，露出心脏和肺部。找到心肺后心大母，夹住末端。用剪刀切除大干，用预冷洗涤缓冲液洗一次。

用无菌钳和剪刀去除大干周围的任何多余的组织，将容器放入含有新鲜预冷洗涤缓冲液的50毫升离心管中，转移到实验室。对于猪大动脉内皮细胞分离，在无菌条件下将猪大动脉转移到150毫米的培养皿中，然后轻轻取出血管的两端。用无菌钳子和剪刀修剪容器被夹住的任何额外组织，并使用 20 至 50 毫升的新鲜洗涤缓冲液冲洗大干的内外。

接下来，通过手术缝合通过大血管，并松散地绑住容器的一端，保持缝合线在流明内。用钳子轻轻固定靠近绑端的大动脉，然后缓慢地拉下手术缝合线，反转大动脉，直到大动脉的内皮表面暴露。每次洗涤用 10 毫升新鲜洗涤缓冲液洗大动脉的内皮表面三次，将大动脉放入 15 毫升离心管中。

用10毫升37摄氏度加热0.005%胶原酶IV消化液，在37摄氏度下孵育组织15分钟。在孵育结束时，将整个管内物转移到100毫米培养盘中，用10至15毫升预冷却停止缓冲液停止消化。使用细胞刮刀，轻轻地从容器内表面取出大动脉内皮细胞，每次洗涤用五毫升洗涤缓冲液洗涤容器三次。

上次洗涤后，将上清液转移到50毫升离心管中，用5毫升的新鲜洗涤缓冲液洗涤培养皿底部两次，每次洗涤，将洗涤液拉入50毫升管中。通过离心收集细胞，并丢弃所有，但最后10毫升的上经剂。加入20毫升的洗涤缓冲液以重新填充颗粒，注意避免气泡，并收集细胞与另一个离心。

将颗粒重新在一毫升细胞培养中进行计数，并在每25厘米平方的烧瓶浓度中，以1倍10至6个细胞的镀块。然后将细胞培养孵化器中的细胞在5%的二氧化碳中放在37摄氏度，每两到三天刷新一次培养基。隔离后，在第1天、第1天和2天检查内皮细胞，并在第1天和2日通过后检查污染及其形态评估。

使用抗CD31-FITC抗体进行流动细胞计量分析表明，在培养的第三天，一般大于97%的内皮细胞标记阳性群体，即使在两次通过后，其纯度也保持在90%以上。大动脉的内皮表面只刮向一个方向，用细胞刮刀刮，不到10次，在刮擦过程中没有压缩。最好的答案，优化的pAECs分离方法，我们可以使用纯化的pAECs进行个别实验，并研究异种移植中的免疫排斥和凝固反应。