在这里，我们展示了我们的原代小鼠肝脏正弦细胞分离或LSECs分离方案。该方案包括肝胶原酶灌注和用于非实质细胞纯化的低速超速离心和CD146磁珠选择。我们的LSEC分离方法非常高效，适用于健康和患病的小鼠肝脏。
分离的LSECs具有高纯度，并保持了结构和功能。使用此协议分离的LSECs是功能和分子研究以及多组学数据生成的最佳选择。该方案将有助于研究肝脏中的细胞间通讯。
首先在10厘米培养皿上涂上三毫升胶原蛋白溶液。然后，将培养皿在室温下孵育一小时。一小时后，从涂层表面除去多余的液体。
用PBS清洗碗碟三次，让它们风干。设置加热加湿的再循环灌注装置。使用10%漂白剂冲洗灌注系统五分钟。
然后，再次用无菌水冲洗系统10分钟。在用胶原酶溶液灌注之前，请尽可能多地沥干冲洗液。通过灌注系统注入胶原酶溶液，将其预热至37摄氏度。
在速度控制拨盘上将泵速设置为速度 1。在整个过程中保持相同的速度。称量鼠标以进行该过程。
然后将其固定在手术表面上。用70%乙醇喷洒小鼠腹部。使用手术剪刀，从腹部下部开始到xiphoid过程，做一个大约五厘米的切口。
之后，在腹部两侧使用小虹膜剪刀进行两次横向切口，以完全暴露腹部器官。将静脉导管的鞘放在动物的背部下方，以抬起并平整腹部。使用常规的弯曲敷料镊子，轻轻地将肠道和胃拉到动物的左侧。
然后，在下腔静脉或IVC下放置5-0的手术缝合线，就在暴露的左肾下方。在缝合线中系上松散的挂钩。接下来，在肝门静脉周围再放置一个5-0的手术缝合线。
将缝合线放在肝门静脉的脾静脉分支点的正上方。再次，在缝合线中系上松散的挂钩。使用门静脉缝合线作为张力，将 20 号静脉导管插入肝门静脉以下 1 厘米处，该导管向右和左肝门静脉分支。
然后，将导管向上滑动静脉，但将其保持在分支区域下方。让血液沿着导管向动，直到它开始滴出。用门静脉缝合线固定静脉导管。
使用IV线将带有缓冲液A的IV瓶连接到导管上。然后，用这种溶液冲洗肝脏，同时避免空气进入系统。将肾下方IVC周围的缝合线绑起来。
之后，将IVC切到缝合线下方，让动物流血。灌注后，切除附着在肝脏上的胃，肠，脾脏和其他内脏。然后，从胸腔切除隔膜和主要血管。
从动物身上取出肝脏并将其放在灌注盘上。小心地取出静脉输液管线，并将胶原酶溶液连接到再循环室中。让肝脏灌注，直到胶囊变得模型化并呈现糊状。
这通常需要 10 到 15 分钟。消化后，从腔室中取出肝脏并将其放在10厘米的培养皿上，其中含有约20毫升无血清DMEM。用几个移液器吸头轻轻挑开肝脏，丢弃胆道树。
之后，通过70微米的细胞过滤器将肝脏悬浮液过滤到50毫升的锥形管中。在室温下以50倍G离心细胞悬浮液两分钟。然后，收集含有非实质肝细胞的上清液。
将上清液在4摄氏度下以300倍G离心五分钟。之后，收集细胞沉淀并将其重悬于一毫升分离缓冲液中。按照制造商的说明使用自动细胞计数器确定细胞编号。
接下来，离心细胞悬浮液。完全吸出上清液，并用每1000万个细胞90微升的分离缓冲液重悬沉淀。每1000万个细胞中加入10微升CD146微珠。
充分混合，在4摄氏度下孵育15分钟。为了洗涤细胞，每1000万个细胞加入1至2毫升的分离缓冲液。将溶液以300倍G离心10分钟。
之后，完全吸出上清液，并在500微升的分离缓冲液中重悬多达10亿个细胞。接下来，通过用三毫升分离缓冲液冲洗来制备分离柱。将细胞悬浮液涂在堆叠有70微米预分离过滤器的色谱柱上。
用三毫升分离缓冲液洗涤色谱柱三次。之后，从分离器中取出色谱柱并将其放在15毫升离心管上。将五毫升分离缓冲液移液到色谱柱上。
要恢复磁珠标记的细胞，请用力将柱塞推入色谱柱以冲洗出细胞。最后，在4摄氏度下以300倍G离心细胞5分钟。用流式细胞术评估分离的LSECs纯度和表面标志物。
门控LSEC和单线的数据分析和门控策略基于前向散射和侧散射数据。用活性染料和CD45，CD146和稳定素-2抗体的组合染色分离的LSECs。对CD45阴性人群进行活LSECs门控，并分析CD146和稳定素-2的表达。
从这些数据中可以证实，分离出的LSECs具有大于94%的生存能力和大于90%的纯度。使用光学显微镜和扫描电子显微镜进一步证实了分离细胞的LSAC特异性表型。分离的LSECs在完整的生长培养基中培养六小时，并通过光学显微镜检查。
SEM图像中的白色箭头表示LSE开窗，这是LSEC的特征性形态特征。确保肝脏组织完全灌注的关键步骤是正确的导管胶带定位，避免在导管中引入空气，以及胶原酶消化的最佳时机。使用我们的方案获得的高质量LSEC将有助于鉴定LSEC功能的分子机制，并将提高我们对它们在肝脏，健康和疾病中细胞间通讯中的作用的理解。
