Isolement et culture des cellules endothéliales aortiques primaires des porcs miniatures

La méthode est une méthode très efficace pour isoler les cellules endothéliales du porc miniature. Et les cellules peuvent être élargies aussi, étudier la réponse immunitaire et de coagulation dans la xénotransplantation. Le principal avantage de la technique est qu’il est non seulement facile, très efficace pour isoler les cellules d’endothélium hautement purifiées du porc, mais aussi mieux pour garder d’autres PAC lorsqu’ils sont adoptés.

Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de douleur chez le porc anesthésié, laver la paroi abdominale porcine trois fois avec 75% d’alcool médical, et une teinture d’iode. Après le dernier lavage, utilisez un scalpel pour faire une incision abdominale pour exposer le cava vena inférieur, et utilisez une seringue de cinq millilitres pour injecter 5000 unités de sodium héparine dans le cava vena inférieur. Après cinq minutes, insérer un cathéter dans l’aorte abdominale, et utiliser un scalpel pour inciser le diaphragme.

Avec l’aide d’un deuxième enquêteur, enlever le ventricule gauche et utiliser des forceps osseux pour exciser les côtes pour exposer le cœur et les poumons. Localiser l’aorte postérieure au cœur et aux poumons, et serrer les extrémités. Utilisez des ciseaux pour exciser l’aorte et lavez-la une fois avec un tampon de lavage pré-refroidi.

Enlevez tout excès de tissu autour de l’aorte avec des forceps stériles et des ciseaux, et placez le récipient dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres contenant un tampon de lavage frais pré-refroidi pour le transfert au laboratoire. Pour l’isolement des cellules endothéliales aortiques porcins, transférer l’aorte porcine dans une boîte de Pétri de 150 millimètres dans des conditions aseptiques, et retirer délicatement les deux extrémités du récipient. Coupez tout excès supplémentaire de tissu où le récipient avait été serré, avec des forceps stériles et des ciseaux, et utilisez 20 à 50 millilitres de tampon de lavage frais pour rincer l’extérieur et l’intérieur de l’aorte.

Ensuite, passez une suture chirurgicale à travers l’aorte, et attachez lâchement une extrémité du vaisseau, en gardant la suture dans le lumen. Fixez doucement l’aorte près de l’extrémité attachée avec des forceps, puis tirez la suture chirurgicale lentement, pour inverser l’aorte, jusqu’à ce que la surface endothéliale de l’aorte soit exposée. Laver la surface endothéliale de l’aorte trois fois avec 10 millilitres de tampon de lavage frais par lavage, et placer l’aorte dans un tube centrifugeuse de 15 millilitres.

Couvrir l’échantillon de 10 millilitres de 37 degrés Celsius réchauffé 0,005%collagène IV solution digestive, et incuber le tissu à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. À la fin de l’incubation, transférer le contenu entier du tube dans un plat de culture de 100 millimètres et arrêter la digestion avec 10 à 15 millilitres de tampon d’arrêt pré-refroidi. À l’aide d’un grattoir cellulaire, retirer délicatement les cellules endothéliales aortiques de la surface intérieure du récipient et laver le récipient trois fois avec cinq millilitres de tampon de lavage par lavage.

Après le dernier lavage, transférer le supernatant dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres, et laver le fond du plat de culture deux fois avec cinq millilitres de tampon de lavage frais, par lavage, tirant les lavages dans le tube de 50 millilitres. Recueillir les cellules par centrifugation, et jeter tous sauf les 10 derniers millilitres de supernatant. Ajouter 20 millilitres de tampon de lavage pour résuspendre la pastille, en prenant soin d’éviter les bulles, et de recueillir les cellules avec une autre centrifugation.

Resuspendez la pastille en un millilitre de milieu de culture cellulaire pour le comptage, et plaquez les cellules à une fois dix aux six cellules par concentration carrée de flacon de 25 centimètres. Placez ensuite les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone à 5 %, rafraichissant le milieu tous les deux à trois jours. Après isolement, les cellules endothéliales sont inspectées le jour zéro, un et deux, et après les passages un et deux pour la contamination et leur évaluation morphologique.

L’analyse cytométrique de flux utilisant un anticorps anti-CD31-FITC indique une population positive généralement supérieure à 97% de marqueur de cellules endothéliales le troisième jour de la culture, qui est maintenue à une pureté de plus de 90%, même après deux passages. La surface endothéliale de l’aorte a été grattée dans une seule direction, avec un grattoir cellulaire, pour moins de 10 fois, et il n’a pas été comprimé pendant le processus de grattage. Meilleure réponse, méthode optimisée d’isolement des PAECs, nous pouvons utiliser des PAC purifiés pour effectuer des expériences individuelles et étudier le rejet immunitaire et la réponse à la coagulation dans la xénotransplantation.