O método é um método altamente eficaz para isolar células endoteliais de suínos em miniatura. E as células também podem ser expandidas, investigar a resposta imune e coagulação na xenotransplante. A principal vantagem da técnica é que não só é fácil, altamente eficaz isolar células de endotélio altamente purificadas do porco, mas também melhor para manter outros pAECs quando passagem.
Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo da dor no porco anestesiado, lave a parede abdominal suína três vezes com 75% de álcool médico e uma tintura de iodo. Após a última lavagem, use um bisturi para fazer uma incisão abdominal para expor a veia cava inferior, e use uma seringa de cinco mililitros para injetar 5000 unidades de sódio de heparina na veia cava inferior. Após cinco minutos, insira um cateter na aorta abdominal e use um bisturi para incisar o diafragma.
Com a ajuda de um segundo investigador, remova o ventrículo esquerdo e use fórceps ósseos para extirpar as costelas para expor o coração e os pulmões. Localize a aorta posterior para o coração e pulmões, e aperte as extremidades. Use uma tesoura para extiridar a aorta e lave-a uma vez com tampão de lavagem pré-resfriado.
Remova qualquer excesso de tecido ao redor da aorta com fórceps estéreis e tesouras, e coloque o vaso em um tubo de centrífuga de 50 mililitros contendo tampão de lavagem pré-resfriado fresco para transferência para o laboratório. Para o isolamento da célula endotelial porcina, transfira a aorta de porco para uma placa de petri de 150 milímetros em condições assépticas, e remova suavemente ambas as extremidades do vaso. Apare qualquer excesso adicional de tecido onde o vaso tenha sido fixado, com fórceps estéreis e tesouras, e use 20 a 50 mililitros de tampão de lavagem fresco para enxaguar o exterior e o interior da aorta.
Em seguida, passe uma sutura cirúrgica através da aorta, e amarre vagamente uma extremidade do vaso, mantendo a sutura dentro do lúmen. Fixar suavemente a aorta perto da extremidade amarrada com fórceps e, em seguida, puxar a sutura cirúrgica lentamente, para reverter a aorta, até que a superfície endotelial da aorta seja exposta. Lave a superfície endotelial da aorta três vezes com 10 mililitros de tampão de lavagem fresco por lavagem, e coloque a aorta em um tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Cubra a amostra com 10 mililitros de 37 graus Celsius aquecidos 0,005% de solução digestiva IV de colagenase, e incubar o tecido a 37 graus Celsius por 15 minutos. No final da incubação, transfira todo o conteúdo do tubo para um prato de cultura de 100 milímetros, e prenda a digestão com 10 a 15 mililitros de tampão de parada pré-resfriado. Usando um raspador de célula, remova suavemente as células endoteliais aórticas da superfície interna do vaso, e lave o vaso três vezes com cinco mililitros de tampão de lavagem por lavagem.
Após a última lavagem, transfira o supernatante para um tubo de centrífugas de 50 mililitros, e lave o fundo do prato de cultura duas vezes com cinco mililitros de tampão de lavagem fresco, por lavagem, puxando as lavagens no tubo de 50 mililitros. Recolher as células por centrifugação, e descartar todos, menos os últimos 10 mililitros de supernascedor. Adicione 20 mililitros de tampão de lavagem para resuspensar a pelota, tomando cuidado para evitar bolhas, e coletar as células com outra centrifugação.
Resuspenque a pelota em um mililitro de meio de cultura celular para contar, e plaque as células em uma única vez dez para as seis células por 25 centímetros de concentração de frascos quadrados. Em seguida, coloque as células na incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono, refrescando o meio a cada dois ou três dias. Após o isolamento, as células endoteliais são inspecionadas nos dias zero, um e dois, e após passagens um e dois para contaminação e sua avaliação morfológica.
A análise citométrica de fluxo usando um anticorpo anti-CD31-FITC indica uma população tipicamente maior do que 97% de marcador de células endoteliais no terceiro dia de cultura, que é mantida com mais de 90% de pureza mesmo após duas passagens. A superfície endotelial da aorta foi raspada em apenas uma direção, com um raspador de células, por menos de 10 vezes, e não foi comprimida durante o processo de raspagem. Melhor resposta, método otimizado de isolamento de pAECs, podemos usar pAECs purificados para realizar experimentos individuais e investigar a rejeição imune e a resposta à coagulação na xenotransplante.
