Yöntem minyatür domuz endotel hücrelerini izole etmek için son derece etkili bir yöntemdir. Ve hücreler de genişletilebilir, knenotransplantasyonda immün ve pıhtılaşma yanıtını araştırın. Tekniğin ana avantajı domuz son derece saflaştırılmış endotel hücrelerini izole etmek için sadece kolay, son derece etkili değil, aynı zamanda diğer PAECs ne zaman geçerken tutmak için daha iyi olmasıdır.
Anestezi domuz ağrı refleks yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, domuz karın duvarı üç kez yıkamak 75% tıbbi alkol, ve iyot bir tentür. Son yıkamadan sonra, inferior vena kava ortaya çıkarmak için bir karın kesi yapmak için bir neşter kullanın, ve inferior vena kava içine heparin sodyum 5000 birim enjekte etmek için beş mililitreşli şırınga kullanın. Beş dakika sonra, abdominal aort içine bir kateter takın ve diyafram incise için bir neşter kullanın.
İkinci bir araştırmacı yardımıyla, sol ventrikül kaldırmak ve kalp ve akciğerlerortaya çıkarmak için kaburga çıkarmak için kemik forseps kullanın. Kalp ve akciğerler için aort posterior bulun ve uçları kelepçe. Aort çıkarmak için makas kullanın ve önceden soğutulmuş yıkama tampon ile bir kez yıkayın.
Steril forseps ve makas ile aort çevresindeki herhangi bir fazla doku çıkarın ve laboratuvara transferi için taze önceden soğutulmuş yıkama tampon içeren 50 mililitrelik santrifüj tüp içine gemi yerleştirin. Domuz etit liyal hücre izolasyonu için domuz aortunu aseptik koşullarda 150 milimetrelik petri kabına aktarın ve geminin her iki ucunu nazikçe çıkarın. Damarın kenetlendiği ek fazla dokuyu steril çalgılar ve makaslarla kırpın ve aortun dışını ve içini durulamak için 20 ila 50 mililitre taze yıkama tamponu kullanın.
Sonra, aort yoluyla cerrahi bir dikiş geçmek ve gevşek lumen içinde dikiş tutarak, geminin bir ucunu kravat. Aortun endotel yüzeyine maruz kalana kadar aortu ters çevirmek için aortu yavaşça bağlı ucuna yakın aortun ucunu ponplarla sabitle ve sonra cerrahi sütürü yavaşça çekin. Aort endotel yüzeyini yıkama başına 10 mililitre taze yıkama tamponu ile üç kez yıkayın ve aortu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
37 santigrat derece 10 mililitre ile kapak% 0.005 kollajenaz IV sindirim çözeltisi ısıtılır ve 15 dakika boyunca 37 santigrat derece doku kuluçka. Kuluçka sonunda, 100 milimetrelik bir kültür çanağı içine tüm tüp içeriğini aktarmak ve önceden soğutulmuş durdurma tampon 10 ila 15 mililitre ile sindirim tutuklama. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, yavaşça kabın iç yüzeyinden aort endotel hücreleri kaldırmak ve yıkama başına yıkama tampon beş mililitre ile üç kez kabı yıkayın.
Son yıkamadan sonra, 50 mililitrelik bir santrifüj tüp içine supernatant aktarın ve yıkama başına, 50 mililitrelik tüp yıkama çekerek, taze yıkama tampon beş mililitre ile kültür çanak iki kez alt yıkayın. Santrifüj ile hücreleri toplamak ve supernatant son 10 mililitre hariç tüm atın. Pelet resuspend için yıkama tampon 20 mililitre ekleyin, kabarcıklar önlemek için özen, ve başka bir santrifüj ile hücreleri toplamak.
Toplama için hücre kültürü orta bir mililitre pelet resuspend ve 25 santimetre kare şişe konsantrasyonu altı hücre ye bir kez on hücreleri plaka. Daha sonra hücre kültürü kuluçka makinesindeki hücreleri %5 karbondioksitte 37 derecede yerleştirin ve her 2-3 günde bir ortamı yeniler. İzolasyondan sonra endotel hücreleri sıfır, birinci ve ikinci gün ve birinci ve ikinci geçitlerden sonra kontaminasyon ve morfolojik değerlendirmeleri için denetlenir.
Bir anti-CD31-FITC antikor kullanarak akış sitometrik analizi kültürün üçüncü gününde tipik olarak %97'den daha büyük bir endotel hücre belirteci pozitif popülasyongösterir ve bu iki pasajdan sonra bile %90'ın üzerinde saflıkta korunur. Aort endotel yüzeyi sadece bir yönde kazınmış, bir hücre kazıyıcı ile, az 10 kez, ve kazıma işlemi sırasında sıkıştırılmış değildi. En iyi cevap, pAECs izolasyon optimize yöntemi, biz bireysel deneyler gerçekleştirmek ve ksenotransplantasyon bağışıklık reddi ve pıhtılaşma yanıtı araştırmak için saflaştırılmış pAECs kullanabilirsiniz.
