与RNA结合的蛋白质对细胞生理学至关重要。重要的是，RBP在整个精子生成过程中都表达得非常强烈，并且在生殖细胞的所有阶段都作为重要的转录后调节器被很好地记录。确定绑定目标对于阐明 RBP 的机械作用至关重要。
该协议代表了黄道针方法的适应应用，用于捕获内源性直接RNA靶点，并建立了在哺乳动物睾丸中黄热化的适用基础。此方法的主要优点是，它是非放射性的，时间密集程度更低，并提供更强的信号噪声比，因为大小匹配输入将作为真实目标的适当背景。最后，我们认为亚组酮的小规模测序对于深度测序是有用的。
演示程序将是徐秋实，我的同事。为了开始这个程序，从每个免疫沉淀实验中从适当年龄的小鼠身上收获大约100毫克的睾丸。将组织放在冰冷的 PBS 中。
使用一对细尖的钳子，轻轻取出图尼卡阿尔布吉纳。在组织研磨机中加入三毫升冰冷的PBS，并使用松玻璃用温和的机械力将组织三联。接下来，将组织悬浮液转移到细胞培养皿中，并加入多达六毫升的冰冷PBS。
快速摇动盘子，使液体均匀地覆盖盘子底部。在254纳米时，将悬浮在冰上三次，每厘米400毫焦耳。确保将悬浮液混合在每次辐照之间。
然后，在15毫升锥形管中收集悬浮液，并在1，200倍g和4度下离心5分钟。取出上一液，将颗粒重新在一毫升PBS中。在此之后，将悬浮液转移到1.5毫升离心管。
在1000倍的g和4摄氏度的离心2分钟，并丢弃上一代。首先，将每个样品的125微升蛋白质 A 磁珠添加到新鲜的离心管中。将管子放在磁铁上，将珠子与溶液分离。
10秒后，取出上清液，用一毫升冰冷解液缓冲液洗涤珠子两次。将珠子用10微克的黄心抗体重新填充在100微升的冷解解缓冲液中。在室温下旋转管45分钟。
然后，用一毫升的冰冷解液缓冲液清洗珠子两次。首先，将组织颗粒重新泵中一毫升的冷解液缓冲液中，其中含有22微升50倍无EDTA蛋白抑制剂鸡尾酒和11微升RNase抑制剂。在冰上保持 15 分钟的样品。
对文本协议中概述的每个样本进行声波化。接下来，在每个管中加入四个微升的DNase，并混合好。在 37 摄氏度下孵育 10 分钟，同时在转速 1200 rpm 时摇晃。
在此之后，加入10微升稀释的RNase，混合好。在37摄氏度下孵育5分钟，同时在1200转/小时摇晃。然后，在15，000倍g和4摄氏度的离心机20分钟，以清除酸盐。
仔细收集上一液，并保存 RWB 和 RRI 样品的输入样本。首先，在准备好的珠子中加入一毫升的落酸，在四摄氏度下旋转样品两小时或一夜。在此之后，用磁性支架收集珠子，并丢弃上经剂。
用900微升高盐缓冲液清洗珠子两次，然后用900微升的洗涤缓冲液洗涤珠子两次。然后，用500微升1倍脱磷缓冲液清洗珠子一次。首先，丢弃上清液，并使用细移液器尖端去除任何残留液体。
在每个样品中加入25个三主要结扎主混合物的微升，并小心地将移液器混合。在每个样品中加入2.5微升RNA适配器X1A和2.5微升RNA适配器X1B。通过移液或轻拂小心混合。
在25摄氏度下孵育75分钟，确保轻拂管混合每10分钟。用500微升冷洗缓冲液清洗珠子一次。接下来，用500微升的冷高盐缓冲液洗一次珠子，然后用500微升的冷洗缓冲液清洗珠子。
重复这两个洗涤再次。磁性分离珠子，并使用精细移液器尖端去除任何残留液体。将珠子重新填充在 100 微升冷洗缓冲液中，然后将 20 微升作为 RWB 样品移动到新管中。
将 7.5 微升 4x LDS 样品缓冲液和 3 个 10x 样品还原剂微升添加到其余样品中。在 70 摄氏度下孵育 10 分钟，同时在 1200 rpm 时摇晃。之后，在冰上冷却样品一分钟，在1000次g和4摄氏度下离心1分钟。
对于 RWB 凝胶，将管子放在磁铁上，将蛋白质从珠子中分离出。将 15 微升样品加载到每个井中。接下来，在500毫升的1xSDS运行缓冲液中加入500微升的抗氧化剂。
以 200 伏、1 倍 SDS 运行缓冲液 50 分钟或直到染料前部底部运行凝胶。将蛋白质-RNA复合物从凝胶转移到硝基纤维素膜中，在10伏特的1x转移缓冲液中，用10%甲醇将70分钟。在室温下将 5%牛奶中的 RWB 膜在 TBST 中阻塞一小时。
在TBST中冲洗膜，并在4摄氏度下用TBST中的原抗体孵育。在此之后，用 TBST 洗两次，每次洗涤持续五分钟。在室温下用二次抗体在TBST中孵育一小时。
然后，用TBST清洗膜三次。接下来，混合等量的ECL缓冲液 A 和缓冲液 B.将这种混合物添加到膜中，孵育一分钟。用塑料包装盖住膜，在室温下将其暴露在 X 射线膜上两到三分钟，然后再开发薄膜。
在这项研究中，MOV10黄道从成年野生型小鼠与RNase I治疗交联的利萨酸盐，目标蛋白，这是约114千吨，成功地丰富。从各种样品中稀释一至十的cDNA的qPCR结果表明，非交联样品的RNA回收率下降。观察到非交联组的 Ct 值通常比 UV 交联组的五倍以上。
此处显示了通过气糖凝胶电泳进行PCR扩增和尺寸选择具有代表性的结果。底向-二丁车产品出现在大约 140 个基对上。两个代表性子束序列的 UCSC 基因组浏览器视图显示，MOV10 绑定的黄道卡标签位于基因 Fto 的三主 UTR 内。
三等 UTR 目标的近似速率为 75%，与 HEK293 细胞和睾丸中的大多数 MOV10 目标一致。相比之下，MOV10L1绑定的黄道标记位于piRNA聚类内，指示MOV10L1目标piRNA前体。piRNA前体靶目标的近似率为42%，这反映了以往研究的趋势。
MOV10L1 转点与 40 单位每毫升 RNase I 消化产生相对更多的序列，小于 20 个碱基对。此处描述的此协议代表了黄道方法在复制中的采用，而这一领域RNA-RBP相互作用知识相当不足。
