חלבונים מחייבי RNA חיוניים לפיזיולוגיה תאית. חשוב לציין, RBP באים לידי ביטוי מאוד ברחבי spermatogenesis ותועדו היטב כמו רגולטורים חיוניים שלאחר שעתוק בכל השלבים של תאי נבט. זיהוי יעדי איגוד הוא קריטי כדי להבהר את התפקידים המקניסטיים של RBP.
פרוטוקול זה מייצג יישום מותאם של שיטת eCLIP ללכידת מטרות RNA ישיר אנדוגני ומבסס בסיס ישים עבור eCLIP באדיס יונקים. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא אינה רדיואקטיבית, פחות עתירת זמן, ומספקת יחס אות לרעש חזק יותר מכיוון שהקלט התואם לגודל ישמש רקע מתאים ליעדים אותנטיים. לבסוף, אנו חושבים כי רצף בקנה מידה קטן של subclones שימושיים בעקבות רצף עמוק.
הדגמת ההליך תהיה שו צ'ישי, עמיתי. כדי להתחיל בהליך זה, לקצור כ -100 מיליגרם של אשכים מעכברים בגיל המתאים לכל ניסוי immunoprecipitation. מניחים את הרקמות ב-PBS קר כקרח.
בעזרת זוג פינצטה עדינה, הסירו בעדינות את הטוניקה אלבגינאה. הוסיפו שלושה מיליליטר של PBS קר כקרח למטחנה רקמות, ולהשתמש עלה זכוכית רופף כדי triturate הרקמה על ידי כוח מכני מתון. לאחר מכן, להעביר את ההשעיה רקמה לצלחת תרבות התא, ולהוסיף PBS קר כקרח עד שישה מיליליטר.
לנער את הצלחת במהירות, כך נוזל מכסה את החלק התחתון של המנה באופן שווה. לחצות את ההשעיה על קרח שלוש פעמים עם 400 מילי-ג'אול לס"מ בריבוע ב 254 ננומטר. הקפד לערבב את ההשעיה בין כל הקרנה.
לאחר מכן, לאסוף את ההשעיה בצינור חרוט 15 מיליליטר, וצנטריפוגה ב 1, 200 פעמים g וב ארבע מעלות במשך חמש דקות. הסר את supernatant, ולתלות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן, להעביר את ההשעיה לצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר.
צנטריפוגה ב 1, 000 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך שתי דקות, ולהשליך את העל טבעי. ראשית, מוסיפים 125 מיקרוליטרים של חלבון חרוזים מגנטיים לכל מדגם לצינור צנטריפוגה טרי. מניחים את הצינור על המגנט כדי להפריד את חרוזים מהפתרון.
לאחר 10 שניות, להסיר את העל טבעי, ולשטוף את חרוזים פעמיים עם מיליליטר אחד של חיץ תיזה קר כקרח. תן שימוש חוזר את חרוזים ב 100 microliters של חיץ תיזה קרה עם 10 מיקרוגרם של נוגדן eCLIP. לסובב את הצינורות בטמפרטורת החדר במשך 45 דקות.
לאחר מכן, לשטוף את חרוזים פעמיים עם מיליליטר אחד של חיץ תיזה קר כקרח. כדי להתחיל, תן שימוש חוזר כדורי הרקמה במיליליטר אחד של חיץ תזה קרה המכיל 22 microliters של 50x EDTA ללא קוקטייל מעכבי חלבון ו 11 microliters של מעכבי RNase. שמור lysing הדגימות על קרח במשך 15 דקות.
Sonicate כל מדגם כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, מוסיפים ארבעה מיקרוליטרים של DNase לכל צינור ומערבבים היטב. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות תוך טלטול ב 1, 200 סל"ד.
לאחר מכן, להוסיף 10 microliters של RNase מדולל ומערבבים היטב. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות תוך רעידות ב 1, 200 סל"ד. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 15, 000 פעמים g וב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כדי לנקות את ליאזט.
בזהירות לאסוף את supernatant, ולשמור דגימות קלט עבור דגימות RWB ו- RRI. ראשית, מוסיפים מיליליטר אחד של הליסאט לתרוזים המוכנים, ומסובבים את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים או לילה. לאחר מכן, לאסוף את חרוזים עם מעמד מגנטי, ולהשליך את העל טבעי.
לשטוף את חרוזים פעמיים עם 900 microliters של חיץ מלח גבוה, ולאחר מכן לשטוף את חרוזים פעמיים עם 900 microliters של חיץ לשטוף. לאחר מכן, לשטוף את חרוזים פעם אחת עם 500 microliters של חיץ dephosphorylation 1x. ראשית, להשליך את העל טבעי, ולהשתמש טיפים פיפטה בסדר כדי להסיר כל נוזל שיורית.
הוסיפו 25 מיקרוליטרים של תערובת ראשית של שלוש רצועות עיקריות לכל דגימה, ובדקו בזהירות את פיגט לערבב. הוסף 2.5 מיקרוליטרים של מתאם RNA X1A ו- 2.5 מיקרוליטרים של מתאם RNA X1B לכל דגימה. מערבבים היטב על ידי צינורות או הבהוב.
דגירה ב 25 מעלות צלזיוס במשך 75 דקות, הקפדה על להעיף את הצינור לערבב כל 10 דקות. לשטוף את חרוזים פעם אחת עם 500 microliters של חיץ לשטוף קר. לאחר מכן, לשטוף את חרוזים פעם אחת עם 500 microliters של חיץ מלח גבוה קר ולאחר מכן עם 500 microliters של חיץ לשטוף קר.
חזור על שתי שטיפות אלה פעם נוספת. מפרידים מגנטית את חרוזים, ולהשתמש טיפים פיפטה בסדר כדי להסיר כל נוזל שיורית. תוכלו להשתמש מחדש ב-100 מיקרוליטרים של חיץ כביסה קרה, ולעבור 20 מיקרוליטרים לצינורות חדשים כדגימות RWB.
הוסף 7.5 microliters של מאגר מדגם LDS 4x ושלושה microliters של סוכן הפחתת מדגם 10x לדגימות הנותרות. דגירה ב 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות תוך טלטול ב 1, 200 סל"ד. לאחר מכן, לקרר את הדגימות על קרח במשך דקה אחת, צנטריפוגה ב 1, 000 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך דקה אחת.
עבור ג'ל RWB, מניחים צינורות על מגנט, וחלבון נפרד eluate מן חרוזים. לטעון 15 microliters של מדגם לתוך כל באר. לאחר מכן, להוסיף 500 microliters של נוגדי חמצון כדי 500 מיליליטר של חיץ ריצה 1x SDS.
הפעל את הג'ל ב 200 וולט, 1x SDS פועל חיץ במשך 50 דקות או עד חזית הצבע הוא בתחתית. מעבירים את קומפלקס החלבון-RNA מהג'ל לממברנה ניטרוסלולוס ב-10 וולט למשך 70 דקות במאגר העברה של 1x עם 10% מתנול. חסום את קרום ה-RWB ב-5% חלב ב-TBST בטמפרטורת החדר למשך שעה.
יש לשטוף את הממברנה ב-TBST, ולהידגר בנוגדן ראשוני ב-TBST למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשטוף פעמיים עם TBST, עם כל לשטוף נמשך חמש דקות. דגירה עם נוגדן משני ב- TBST בטמפרטורת החדר למשך שעה.
לאחר מכן, לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBST. לאחר מכן, מערבבים נפחים שווים של מאגר ECL A ומאגר B.מוסיפים תערובת זו לממברנה, וגוררים במשך דקה אחת. מכסים את הממברנה בניילון נצמד, וחושפים אותה לסרט רנטגן בטמפרטורת החדר במשך שתיים עד שלוש דקות לפני פיתוח הסרט.
במחקר זה, MOV10 eCLIP אשכים מעכברים מסוג בר למבוגרים עם RNase אני מטפל lysate crosslinked, חלבון היעד, שהוא כ 114 קילודלטונים, מועשר בהצלחה. תוצאות qPCR של cDNA מדולל אחד עד 10 מדגימות שונות מגלה כי דגימות שאינן מקושרות להראות התאוששות RNA ירד. הוא ציין כי ערכי Ct של הקבוצה שאינה מקושרת הוא בדרך כלל חמש פעמים יותר מאשר UV-crosslinked קבוצה.
תוצאות מייצגות עבור הגברה PCR ובחירת גודל באמצעות אלקטרופורזה ג'ל אגרוז מוצגים כאן. מוצר פריימר-דימר מופיע בכ-140 זוגות בסיסים. תצוגת דפדפן הגנום של UCSC של שני רצפי subclone מייצגים מראה כי תגי eCLIP מאוגדים MOV10 נמצאים ממוקמים בתוך UTR שלוש ראשי של הגן Fto.
הקצב המשוער של יעדי UTR תלת-ראשיים מהווה 75%עולה בקנה אחד עם רוב יעדי MOV10 בתאי HEK293 ובבדיקה. לעומת זאת, תגי eCLIP מאוגדים MOV10L1 נמצאים ממוקמים בתוך אשכול piRNA, המציין MOV10L1 מטרות מבשרי piRNA. השיעור המשוער של יעדי מבשר piRNA מהווה 42% המשקפים מגמה ממחקרים קודמים.
MOV10L1 eCLIP עם עיכול RNase I של 40 יחידות למיליליטר מניב רצפים גדולים יחסית עם פחות מ-20 זוגות בסיסים. פרוטוקול זה המתואר כאן מייצג תעסוקה של שיטת eCLIP ברבייה, אזור שבו הידע על אינטראקציית RNA-RBP אינו מספיק.
