我们改进了以前发布的 RiboTag 方法，以显著减少背景。这使得从分析角度对复杂模型（如突变系统）的应用更加简单，成本更低。除了实验性动物生成之外，RiboTag 方法比分析核糖体相关 mRNA 的方法要容易得多、更直接。
像所有RNA实验一样，严格的无RNase条件是成功的关键。如果您对RNA的经验有限，首先执行基本的RNA提取，然后继续检查您的条件。证明这个程序将是劳伦·丘克雷拉，一个研究生从我的实验室。
为了准备均质缓冲液，在pH 7.4下加入2.5毫升一摩尔三叶，加入5毫升一摩尔氯化钾，600微升一个摩尔氯化镁，500微升MP40到50毫升管中。将二乙基热碳酸盐处理水加入管中，使体积达到 50 毫升并混合，直到整合所有组件。要准备高盐洗涤缓冲液，在 pH 7.4 下加入 2.5 毫升一摩尔三酯，在 50 毫升管中加入 15 毫升一摩尔氯化钾、600 微升一个氯摩尔镁和 500 微升 MP40。
将其带到二乙基热碳酸盐处理水中 50 毫升的体积，并混合，直到所有组件都加入。预称所有样品管，记录重量，并在液氮中预冷却。预冷无菌砂浆，在干冰上测量和称重铲。
然后在干冰上，使用预冷却的无菌砂浆和害虫将闪光冷冻组织样品分解成大块，然后慢慢研磨成细粉。使用预冷铲，将砂浆中粉末刮入预冷却收集管中，尽可能小心地保持干冰。用组织粉末称重管子。
通过从管的重量中减去管的初始重量来计算组织的质量，并包含其中样品。记录此值，以用于以后计算解解缓冲量。通过将10毫升均质缓冲液二磷酸、RNase抑制剂、环氧酶、肝素和一蛋白酶抑制剂片剂加入10毫升来准备解解缓冲液。
混合，直到所有组件被整合并留在冰上，直到使用。每100毫克样品，加入一毫升的解液缓冲液。用用于添加裂解缓冲液的同一移液器，小心移液器，将产生的裂解器上下分解，以分解细胞并混合。
继续移液通常 25 到 30 次冲程，直到样品不再粘稠。将样品放在冰上 10 分钟，以进行。然后在4摄氏度的预冷离心机中旋转样品，在10，000倍的g下旋转10分钟。
管底部形成一个大的松散多云颗粒。小心不要打扰颗粒，将莱酸盐收集到新管中，并记录每个样品的体积。为防止样品降解，请确保样品在整个剩余协议中保持冷却，尽可能储存在冰上或四摄氏度。
现在，计算所需的磁珠体积耦合到适当的抗体结合蛋白，蛋白质G.对于一毫升的利沙酸盐，使用375微升的蛋白质G珠达到每毫升30毫克。将珠溶液放在 1.7 毫升管中的磁管架上。去除珠子溶剂，向珠子中加入同等体积的新鲜解液缓冲液。
在台式管旋转器上设置为 4 摄氏度的 20 RPM，旋转管 5 分钟进行清洗。将管子放在磁管架上，并拆下洗涤缓冲液。再重复洗涤两次后，在原始体积添加解液缓冲液以平衡珠子。
储存在四摄氏度或冰上，直到使用。每一毫升的落酸添加50微升的均等珠子，并在4摄氏度下旋转一小时。然后将管子放在磁铁架上，将落酸收集到新鲜管中。
丢弃用过的珠子。在酸盐上，每毫升加入25微升的平衡珠，在4摄氏度下旋转一小时。将剩余的平衡蛋白G珠在四摄氏度过夜。
早晨，将管子放在磁铁架上，将落酸收集到新鲜管子中。丢弃用过的珠子。从清除的落酸中，保留 50 微升作为样品输入控制。
储存在零下80摄氏度。对于每一毫升的清除利沙酸盐，添加五微克的抗HA抗体。为防止样品流失，用实验室膜密封管盖，并在4摄氏度下旋转样品16至18小时。
对于每一毫升的清除的利沙酸盐，添加300微升的蛋白质G珠。用实验室膜重新密封管盖，并在四摄氏度下旋转两小时。将样品管放在磁铁架上，使珠子与 IPed lysate 分离。
移液关闭流经式莱酸盐并丢弃，保留珠子。在珠子上加入800微升高盐洗涤缓冲液。将管子放在旋转器上 10 分钟，温度为 4 摄氏度。
将样品管放在磁铁架上，让珠子与洗涤器分离。拆下并丢弃洗涤液。再加800微升高盐洗涤缓冲液到珠子上。
关闭管子，让管在摄氏四度下旋转五分钟。将样品管放在磁铁架上，让珠子与洗涤器分离。拆下并丢弃洗涤液。
再次重复洗涤。洗涤后，在珠子中加入3.5微升14.2摩尔β-甲醇，通过涡旋混合15秒。根据制造商的说明使用商用RNA纯化试剂盒提取RNA。
在30微升的RNase无水中收集样品。样品储存在零下80摄氏度。在这项研究中，很少从缺乏Cre或Rpl22HA的样品中分离出很少的RNA，证明该协议在减少IP背景和分离真正的HA标记核糖体RNA方面的有效性。
在Cre和Rpl22HA阳性样品中测试了RNA分离协议中的一系列抗体。这些结果表明，试剂选择会对知识产权效率产生重大影响。研究了核糖核系统分离核糖体相关RNA的有效性。
对于野生类型输入和IP基因型，输入浓度明显高于IP浓度，表明输入样本中RNA更多。在总RNA池中，RNA完整性数值预计接近10，较高的RIN与较高的推断样本完整性和质量相关。虽然IP样本的RIN低于输入，但RIN仍在可接受的范围内，并且不依赖于样品基因型。
除了繁殖和维护无RNase条件外，研究人员还应确保他们收集和保留每个建议的样本。输入RNA是多种类型的下游分析的关键。对于我们的实验室，我们通常在免疫沉淀后进行RNA测序。
这允许我们查询整个成绩单圆顶的核糖体关联。替代方案包括微阵列分析或定量RT-PCR。对我们来说，这个系统使我们能够识别核糖体相关RNA的变化与特定RNA结合蛋白的突变。
