Las proteínas de unión al ARN son esenciales para la fisiología celular. Es importante destacar que el RBP está muy expresado a través de la espermatogénesis y han sido bien documentados como reguladores post-transcripción esenciales durante todas las etapas de las células germinales. La identificación de objetivos vinculantes es fundamental para dilucidar los roles mecánicos de RBP.
Este protocolo representa una aplicación adaptada del método eCLIP para capturar objetivos endógenos de ARN directo y establece una base aplicable para eCLIP en testículos de mamíferos. La principal ventaja de este método es que no es radioactivo, consume menos tiempo y proporciona una relación señal-ruido más fuerte porque la entrada de tamaño coincidente servirá como un fondo adecuado para objetivos auténticos. Por último, creemos que la secuenciación a pequeña escala de subclones es útil para seguir la secuenciación profunda.
Demostrar el procedimiento estará Xu Qiushi, mi colega. Para comenzar este procedimiento, cosechar alrededor de 100 miligramos de testículos de ratones de edad adecuada para cada experimento de inmunoprecipitación. Coloque los tejidos en PBS helado.
Con un par de pinzas de punta fina, retire suavemente la tunica albuginea. Agregue tres mililitros de PBS helado a una trituradora de tejido, y use un pestillo de vidrio suelto para triturar el tejido por fuerza mecánica leve. A continuación, transfiera la suspensión de tejido a un plato de cultivo celular y agregue PBS helado hasta seis mililitros.
Agitar la placa rápidamente para que el líquido cubra la parte inferior del plato uniformemente. Entrentice la suspensión sobre hielo tres veces con 400 milijoules por centímetro cuadrado a 254 nanómetros. Asegúrese de mezclar la suspensión entre cada irradiación.
A continuación, recoja la suspensión en un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugar a 1.200 veces g y a cuatro grados durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y resusppend el pellet en un mililitro de PBS. Después de esto, transfiera la suspensión a un tubo centrífugo de 1,5 mililitros.
Centrifugar a 1.000 veces g y a cuatro grados centígrados durante dos minutos, y deseche el sobrenadante. En primer lugar, añadir 125 microlitros de proteína Una perla magnética por muestra a un tubo de centrífuga fresca. Coloque el tubo en el imán para separar las perlas de la solución.
Después de 10 segundos, retire el sobrenadante y lave las cuentas dos veces con un mililitro de tampón de lelisis helada. Resuspender las perlas en 100 microlitros de tampón de lysis fría con 10 microgramos de anticuerpo eCLIP. Gire los tubos a temperatura ambiente durante 45 minutos.
Luego, lave las cuentas dos veces con un mililitro de tampón de lelisis helada. Para empezar, resuspender los pellets de tejido en un mililitro de tampón de lisis fría que contiene 22 microlitros de 50x cóctel inhibidor de proteína libre de EDTA y 11 microlitros de inhibidor de la RNase. Mantenga las muestras en hielo durante 15 minutos.
Sonicar cada muestra como se describe en el protocolo de texto. A continuación, agregue cuatro microlitros de DNase a cada tubo y mezcle bien. Incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos mientras se agita a 1.200 rpm.
Después de esto, añadir 10 microlitros de RNase diluido y mezclar bien. Incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos mientras agita a 1.200 rpm. Luego, centrifugar a 15.000 veces g y a cuatro grados celsius durante 20 minutos para despejar el izado.
Recoja cuidadosamente el sobrenadante y guarde las muestras de entrada para las muestras RWB y RRI. Primero, agregue un mililitro del izado a las cuentas preparadas, y gire las muestras a cuatro grados Centígrados durante dos horas o durante la noche. Después de esto, recoger las cuentas con un soporte magnético, y descartar el sobrenadante.
Lave las cuentas dos veces con 900 microlitros de tampón de sal alta, y luego lave las cuentas dos veces con 900 microlitros de tampón de lavado. A continuación, lave las cuentas una vez con 500 microlitros de 1x tampón de desfosforilación. En primer lugar, deseche el sobrenadante y use puntas finas de pipeta para eliminar cualquier líquido residual.
Agregue 25 microlitros de mezcla maestra de ligadura de tres prime a cada muestra, y pipetee cuidadosamente para mezclar. Agregue 2,5 microlitros del adaptador de ARN X1A y 2,5 microlitros del adaptador de ARN X1B a cada muestra. Mezclar cuidadosamente pipeteando o parpadeando.
Incubar a 25 grados centígrados durante 75 minutos, asegurándose de mover el tubo para mezclar cada 10 minutos. Lave las cuentas una vez con 500 microlitros de tampón de lavado en frío. A continuación, lave las cuentas una vez con 500 microlitros de tampón frío con alto contenido de sal y luego con 500 microlitros de tampón de lavado en frío.
Repita ambos lavados una vez más. Separe magnéticamente las perlas y use puntas finas de pipeta para eliminar cualquier líquido residual. Resuspender las perlas en 100 microlitros de tampón de lavado en frío, y mover 20 microlitros a nuevos tubos como muestras RWB.
Agregue 7,5 microlitros de 4x búfer de muestra SUD y tres microlitros de agente reductor de muestra 10x a las muestras restantes. Incubar a 70 grados centígrados durante 10 minutos mientras se agita a 1.200 rpm. Después de esto, enfríe las muestras sobre hielo durante un minuto, y centrifugar a 1.000 veces g y a cuatro grados centígrados durante un minuto.
Para el gel RWB, coloque los tubos en un imán y separe eluido de proteína de las cuentas. Cargue 15 microlitros de muestra en cada pozo. A continuación, agregue 500 microlitros de antioxidantes a 500 mililitros de 1x tampón de funcionamiento SDS.
Ejecute el gel a 200 voltios, 1x sdS amortiguador de funcionamiento durante 50 minutos o hasta que el frente del tinte esté en la parte inferior. Transfiera los complejos de ARN proteico del gel a una membrana de nitrocelulosa a 10 voltios durante 70 minutos en tampón de transferencia 1x con 10% de metanol. Bloquear la membrana RWB en 5% de leche en TBST a temperatura ambiente durante una hora.
Enjuague la membrana en TBST e incubar con anticuerpo primario en TBST durante la noche a cuatro grados centígrados. Después de esto, lavar dos veces con TBST, con cada lavado que dura cinco minutos. Incubar con anticuerpos secundarios en TBST a temperatura ambiente durante una hora.
A continuación, lave la membrana tres veces con TBST. A continuación, mezcle volúmenes iguales de tampón ECL A y tampón B.Agregue esta mezcla a la membrana, e incubar durante un minuto. Cubra la membrana con una envoltura de plástico y exponga a una película de rayos X a temperatura ambiente durante dos o tres minutos antes de desarrollar la película.
En este estudio, MOV10 eCLIP en testículos de ratones adultos de tipo salvaje con RNase I tratando el lesato reticulado, la proteína diana, que es de aproximadamente 114 kilodaltones, se enriquece con éxito. Los resultados qPCR de cDNA diluidos de uno a 10 de varias muestras revelan que las muestras no reticuladas muestran una disminución de la recuperación de ARN. Se observa que los valores Ct del grupo no reticulado son generalmente cinco veces más que el grupo reticulado UV.
Los resultados representativos para la amplificación de PCR y la selección de tamaño a través de la electroforesis de gel de agarosa se muestran aquí. El producto de imprimación-dimer aparece en unos 140 pares base. La vista navegador del genoma UCSC de dos secuencias representativas de subclone muestra que las etiquetas eCLIP enlazadas a MOV10 se encuentran dentro de la UTR de tres primos del gen Fto.
La tasa aproximada de objetivos UTR de tres primos representa el 75% es consistente con la mayoría de los objetivos MOV10 en células HEK293 y en testículos. Por el contrario, se encuentra que las etiquetas eCLIP enlazadas a MOV10L1 se encuentran dentro de un clúster de piRNA, lo que indica que MOV10L1 se dirige a los precursores de piRNA. La tasa aproximada de objetivos precursores de piRNA representa el 42%, que reflejan una tendencia de estudios anteriores.
MOV10L1 eCLIP con una digestión RNase I de 40 unidades por mililitro produce relativamente más secuencias con menos de 20 pares de bases. Este protocolo descrito aquí representa un empleo del método eCLIP en la reproducción, un área en la que el conocimiento de interacción ARN-RBP es bastante insuficiente.
