此活体免疫荧光定位方案（IVIL）评估了诊断和治疗抗体或抗体基制剂的体内生物分布，用于癌症研究、检测和治疗。与传统的免疫荧光染色（其中抗原的细胞表达在体内显示，IVIL方法阐明抗体和抗体为基础的制剂在活体动物中分布的方式。本视频将有助于了解 IVIL 方法的整体工作流。
它显示了成功复制协议的其他应用和抗体的重要细节。观察小鼠从所需的癌症模型适当的肿瘤生长通过心或卡钳测量，然后再继续。净化兔子抗小鼠B7-H3和兔子IgG等型控制抗体在脱盐柱上，以去除防腐剂和储存缓冲液，按照制造商的指示。
每种抗体的33微克的等量在单个微离心管中结合。按照文本协议中描述的麻醉后，为抗体溶液的尾静脉接种做好准备。用酒精擦拭三次，对动物的尾巴进行消毒。
用热垫加热约30秒，使尾静脉扩张。避免加热整个动物。使用 27 量尾静脉导管，将蝴蝶针插入两个横向尾静脉之一。
将血液回流可视化到导管中，以确保针头正确放置，使溶液完全进入动物，而不是被捕获在尾部。使用一块手术胶带小心地用插入的针头固定到舞台上的尾巴。用 25 微升无菌磷酸盐缓冲盐水冲洗导管。
然后，使用胰岛素注射器将抗体溶液注射到导管中。使用 25 微升无菌 PBS 再次冲洗导管。从尾巴上取下针头，并施加压力以阻止任何出血。
如文本协议所述，对鼠标进行人道安乐死，将鼠标放在超平位置。使用手术剪刀和钳子切除肿瘤组织。使用钳子只抓住最接近尾部的乳腺之间的皮肤外层，用一把手术剪刀做一个小切口。
将封闭的剪刀放入切口中，然后慢慢打开尖端，小心地将皮肤与底层腹壁膜分开，保持其完好无损。在腹部进行垂直切口，继续将皮肤与内膜分开。在第三和第四乳腺之间，在腹部进行水平切口，允许皮肤缩回和乳腺的可视化。
用钳子抓住每个肿瘤或正常腺体，用手术剪刀小心修剪附着的皮肤。将切除的组织放入组织一次性基模中，这些基模已预标记，并充满最佳的切割温度嵌入介质。将模具放在干冰上，快速冷冻模具。
为了研究非靶向交付，切除其他感兴趣的组织或器官。使用低温恒温器，将 10 微米厚度的节块冷冻组织块，并放置相邻部分，将相邻截面放在预标记的粘附玻璃幻灯片上。用室温 PBS 冲洗冷冻组织幻灯片五分钟，以去除嵌入介质。
使用疏水阻隔屏障笔划定组织部分，以减少染色过程中所需的溶液量。用4%的甲醛溶液修复组织部分5分钟。在 PBS 中冲洗幻灯片 5 分钟后，在 PBS 中用 0.5% Triton X-100 渗透组织部分 15 分钟。
在 PBS 中再次冲洗幻灯片五分钟。在室温下，用PBS将含有每体积牛血清白蛋白3%的重量和每卷山羊血清5%体积的PBS块块组织一小时。在PBS中冲洗幻灯片五分钟后，用记录保持原抗体（如常见的核、血管或细胞质标记）孵育部分。
在这里，大鼠防鼠CD31用于一到100稀释的阻解溶液。含有原抗体的幻灯片在四摄氏度下过夜，防止在滑动托盘上脱水。孵育后，在PBS中冲洗幻灯片五分钟三次。
每次更改 PBS。用二次抗体孵育幻灯片，为初级抗体贴上标签。对于本应用，使用Alexa Fluor 546结合山羊抗兔抗体可视化抗B7-H3抗体，并可视化CD31与Alexa Fluor 488山羊抗大鼠二级抗体的阻断溶液。
在室温下，保护幻灯片免受光线和脱水，在一小时。在 PBS 中像之前一样冲洗幻灯片后，将一滴安装介质放入组织切片的中心。小心放置盖玻片，避免夹住气泡。
用清晰的指甲油密封盖玻片的边缘，并允许干燥。继续按照文本协议中所述进行共声显微镜成像和定量图像分析。代表性共合显显微图显示特定B7-H3抗体-ICG结合物和非特异性异型控制抗体-ICG结合定位在含有正常或癌组织乳腺的乳腺中。
正常乳腺从动物静脉注射Iso-ICG或B7-H3-ICG和与CD31对等显示没有染色的抗体结合。正常组织通过标准外活体免疫荧光染色显示没有B7-H3的表达。在侵入性乳腺肿瘤中，B7-H3-ICG与体内第一接触点血管强烈结合，然后能够从血管外体异质染色肿瘤上皮。
Iso-ICG 显示肿瘤组织内的非特异性积累。标准外体免疫荧光染色显示上皮细胞和内皮细胞上B7-H3标记的均匀表达。代表性共体显微图显示体内免疫荧光定位方法，用于检测乳腺癌和正常乳腺中的网蛋白-1表达或等型控制表达。
体内免疫荧光定位确认MMTV-PyMT肿瘤中网林-1的上皮信号，但在正常乳腺中不确认。此外，在乳腺肿瘤的内皮细胞上还有一个强烈的网林-1信号，如结黄信号所示。正常乳腺中的信号明显较弱。
IVIL方法需要优化抗体剂量、组织采集时间、二次抗体稀释等方法，才能成功实施。IVIL 允许定位使用标准免疫荧光染色无法检测到的构象表位，这需要组织处理。此外，还可以收集带肿瘤小鼠的健康器官，以评估治疗抗体的靶外传递。
随着抗体治疗和对比剂在癌症研究和管理中的使用增加，IVIL方法高度适用于药物研发。癌症治疗、分子成像、炎症和其他领域的研究人员发现，IVIL方法提供了有用的信息。
