用抗体阵列对信号转导通路的审问对酪氨酸激酶抑制剂的抗性评价

此方法可以帮助回答有关信号网络中可能导致癌症生长或对特定疗法的耐药性发展的关键问题。该技术的主要优点是，它可以提供快速和可靠的反馈，对多网络的磷酸化状态，经常解除管制的癌症。该技术的含义延伸到抗药性癌症的治疗，因为改变和翻译后修饰的识别可以阐明信号转导通路活性的变化。

虽然这种技术用于磷酸化，它也可以用来查看其他翻译后修饰，如糖基化和泛基化。首先彻底冲洗隔夜培养细胞三次，10毫升PBS小心切开所有PBS后最后一次洗涤。接下来，从蛋白质测定试剂盒中加入适当体积的解解缓冲液，并使用细胞刮刀分离细胞。

将产生的细胞溶液三解约10次，然后将至少10倍转移到第七细胞到1.5毫升管。在4摄氏度下用震动孵育细胞30分钟。然后将落酸装入装有27表针的注射器中，吸气并分配样品10次，切入细胞膜。

当细胞膜完全被破坏时，将解液离心，然后将上清液转移到新的1.5毫升管中，以便根据标准协议进行后续总蛋白质定量。要进行人类磷酸激酶测定，首先使用平尖钳子将一个阵列膜放入四孔多托盘的每个孔中，该孔包含两毫升新鲜准备的阵列缓冲器，每孔一个孔的膜数量朝上。浸水后，膜上的染料将消失。

用盖子盖住托盘，在室温下在摇床摇床上孵化膜 60 分钟。在阻断孵育过程中，将每个解液样品稀释至50至100微克的蛋白质浓度，最大体积为334微升的解解缓冲液，并将最终提取的蛋白质样品量与新鲜阵列缓冲液一起稀释至1.5毫升。接下来，小心地从多托盘的每个孔中吸出阵列缓冲液，并在摇台摇床上用每孔1.5毫升蛋白质样品孵育膜，在2至8摄氏度的温度下过夜。

第二天早上，小心地将每个阵列转移到单个塑料容器中，里面装着 20 毫升的洗涤缓冲液，在室温下在摇台上清洗 3 个 10 分钟。上次洗涤后，将20微升适当重组的抗体鸡尾酒加入两毫升阵列缓冲液中，每孔两升，并小心地将每膜的下边缘印在纸巾上，以去除多余的洗涤缓冲液。然后将每个阵列放回抗体托盘的适当井中，并在摇台的室温下盖住托盘进行两个小时的孵育。

在孵化结束时，小心地将每个阵列转移到一个新的8乘11厘米的塑料容器中，里面装着20毫升的洗涤缓冲液，进行3次10分钟的洗涤，正如刚才所证明的。上次洗涤后，在多孔托盘的每个孔中加入一毫升适当的链球菌素马萝卜过氧化物酶溶液，并将膜返回适当的井中，在室温下孵育30分钟。在孵化结束时，将每个膜放在两块五毫米滤纸之间，以去除多余的缓冲液，用适当的马萝卜过氧化物酶检测溶液孵育干燥膜三分钟。

然后将膜放入单独的透明塑料板保护器中，以便进行后续成像。要评估每个样本中的受体酪氨酸激酶表达，请在适当的图像处理程序（如图像 J）中打开图像，然后从适当的下拉菜单中选择"编辑"和"反转"，将图像白色背景上的黑点反转到黑色背景上的白色点。接下来，使用"椭圆形"工具将一对白点包围在点印上，然后选择"分析和测量"以自动打开显示选定区域值的新窗口。

然后将鼠标箭头的点放入椭圆形的中心，并拖动下一个点周围的圆形区域，直到测量所有感兴趣点。在这个具有代表性的实验中，在三个酪氨酸激酶抑制剂抗性细胞系中，对酪氨酸激酶抑制剂耐药通路的影响进行了一次控制分析。选择六种具有差分活性的磷蛋白，并确定了每个细胞系中几种候选蛋白的相对强度。

如热图所证明的，可以生成关于重要信号转导蛋白蛋白质磷酸化变化的半定量读出。在尝试此程序时，重要的是要记住从健康和主动分裂的细胞开始，因为压力源可能诱发信号转导通路活性的变化。按照这个程序，其他方法，如数字PCR和免疫印迹可以用来回答其他问题，如磷酸化的变化会导致转录因子的激活？

该技术开发后，为癌症生物学的研究人员探索蛋白质转化后修饰的根本变化铺平了道路，导致癌症患者出现个性化药物。不要忘记，使用癌细胞系是非常危险的，所以一定要使用无菌技术，在处置利器时要小心，并时刻穿着实验室外套。