我们提供从人类多能干细胞产生血细胞。这项技术的主要优点是，我们获得一致和精确的血源内皮细胞产量。我们期望我们的平台能够广泛应用治疗化合物的疾病监测和筛查。
这项技术对血液学和免疫学研究特别有益。该方法可应用于人体血细胞的基因干预或基因编辑。它允许在血源内皮细胞中轻松诱导载体。
最关键的一点是用于键入 PSC 菌落的 LM511-E8 涂层。我们不建议跳过涂层或用其他矩阵代替。视觉演示很重要，因为我们想演示如何使用分离缓冲液冲洗细胞，以及如何用 LM511-E8 涂覆板。
在mTeSR1介质的LM511-E8涂层六井板上，将人类多能干细胞或hPSC生长到70%至80%的汇合点。致血诱导前四天，吸气介质，用PBS洗两次。用分离溶液冲洗细胞，在37摄氏度下孵育15分钟。
在PSC维护介质中重新悬浮细胞，将悬浮液转移到1.5毫升微离心管。将细胞在200倍G下离心三分钟。吸制上一液，并在PSC电镀介质中重新暂停细胞。
根据手稿指示将 PSC 悬浮板到微型润滑塑料容器上，并孵育过夜。在致血诱导前三天，轻轻地将PSC球体移液到15毫升锥形管中，并在室温下离开两分钟，由重力沉淀。吸上流剂，用球形电镀介质重新暂停球体。
将悬浮液分配到 LM511-E8 涂层 10 厘米培养盘中，密度为每平方厘米四个球形，孵育三天。三天后，吸培养基，加入天零分化培养基，在缺氧培养箱中培养细胞两天。然后，吸气日零介质，添加第二天分化介质，再培养两天。
两天后，吸气介质，用PBS洗两次细胞。用分离溶液冲洗细胞，在37摄氏度下用5%的二氧化碳孵育30分钟。孵育后，通过轻轻重新在一毫摩尔EDTA中重新育制细胞，分离细胞。
将悬浮液转移到50毫升锥形管中，并在200次G下将细胞离心3分钟。用300微升磁分离缓冲液吸进上一提液并重新悬浮细胞颗粒。将100微升CD34阳性微珠加入细胞，通过移液轻轻混合。
在室温下孵育30分钟，然后使用40微米细胞过滤器对悬浮液进行应变，并使用磁性分离器分离CD34阳性细胞。将每毫升纤维素溶液 0.5 毫升 5 微克涂装溶液分配到 24 井培养板的每个井中，并在室温下孵育板 30 分钟。同时，将分拣的CD34阳性细胞以200倍G离心3分钟，并在一毫升EHT介质中重新产生颗粒。
使用细胞计数器确定可行的细胞密度，通过添加 EHT 介质将细胞密度调整到每毫升 200，000 个细胞。从纤维素涂层井中吸气并丢弃涂层溶液，并在每口井中分配0.5毫升CD34阳性细胞悬浮液。在缺氧培养箱中孵育细胞一周。
要收集浮式细胞，请将培养培养介质转移到15毫升锥形管，并在200次G下离心3分钟。然后吸上一道。要收集粘附细胞，请用0.5毫升PBS清洗两次，然后用分离缓冲液冲洗。
吸制多余的液体，在37摄氏度下孵育板5分钟。将细胞重新在一毫升的Facs缓冲液中，混合浮动和粘附细胞。将混合细胞在200倍G下离心3分钟，然后吸升上流剂，并在50微升的Facs缓冲液中重新暂停细胞。
在50微升Facs缓冲液中稀释抗CD34和抗CD45抗体;将它们添加到细胞中，在黑暗中室温下孵育细胞一小时。然后，用PBS清洗细胞两次，每次洗涤后以200次G离心，三分钟。吸上液，用每毫升0.5微克的Facs缓冲液重新暂停细胞。
通过流式细胞测量 CD34 和 CD45 表达式。要收集造血细胞，请将培养基转移到15毫升锥形管中。使用 PBS 轻轻冲洗井两次，收集剩余的细胞。
将细胞在200次G下离心3分钟，然后吸升液，再在一毫升EHT介质中重新产生。数数细胞后，将1万个细胞加入三毫升甲基纤维素的分体介质中，补充抗生素，并使用16个量表注射器混合5次。将整个介质悬架分配到六井板的每个井中。
为了保持细胞湿润，在盘子的空井中加入水或PBS。孵育细胞两周，确保不要打扰菜，因为菌落对运动敏感。两周后，在显微镜下计算菌落。
细胞形态在用造血鸡尾酒刺激后从内皮细胞到造血细胞变化。造血细胞菌落在文化中出现。造血前细胞表达CD34和CD45，因此流细胞学通过分析CD34和CD45的表达来确认造血细胞菌落的存在。
菌落形成单元测定表明，从CD34阳性和CD45阳性造血原细胞生成粒细胞或巨噬细胞菌落。据估计，每1万个细胞的菌落数量为38个群落形成单位。最关键的步骤是清点PSC球体。
我们发现表面公制是本协议效率的最决定性因素。这个过程可以遵循现成的内细胞生产，如自然发生的细胞和巨噬细胞。该平台使研究人员能够探索人类造血发育中的关键决定因素。
