Offriamo la produzione di cellule del sangue da cellule staminali pluripotenti umane. Il principale vantaggio di questa tecnica è che otteniamo rese coerenti e precise di cellule endoteliali emogeniche. Prevediamo che la nostra piattaforma consentirà ampie applicazioni nel monitoraggio e nello screening delle malattie per i composti terapeutici.
Questa tecnica è particolarmente utile per la ricerca ematologia e immunologica. Il metodo può essere applicato all'intervento genetico o all'editing genico delle cellule del sangue umane. Permette una facile induzione di vettori nelle cellule endoteliali emogeniche.
Il punto più cruciale è il rivestimento LM511-E8 per la digitazione di colonie PSC. Si sconsiglia di saltare il rivestimento o sostituire con un'altra matrice. Le dimostrazioni visive sono importanti perché vogliamo mostrare come risciacquare le cellule con un buffer di dissociazione e come rivestire le piastre con LM511-E8.
Far crescere le cellule staminali pluripotenti umane o gli hPSC tra il 70 e l'80% di confluenza su una piastra a sei pozzi rivestita con LM511-E8 in mezzo mTeSR1. Quattro giorni prima dell'induzione emogenica, aspirare il mezzo e lavare due volte con PBS. Risciacquare le cellule con soluzione di dissociazione e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti.
Rimescolare le celle in un supporto di manutenzione PSC e trasferire la sospensione in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri. Centrifugare le cellule a 200 volte G per tre minuti. Aspirare il supernatante e rimescolare le cellule nel mezzo di placcatura PSC.
Placcare la sospensione PSC secondo le indicazioni del manoscritto su un recipiente di plastica microfabbricato e incubare durante la notte. Tre giorni prima dell'induzione emogenica, pipettare delicatamente gli sferoidi PSC in un tubo conico da 15 millilitri e lasciarli per due minuti a temperatura ambiente per precipitare per gravità. Aspirare il supernatante e rimescolare gli sferoidi nel mezzo di placcatura sferoide.
Distribuire la sospensione in un piatto di coltura di 10 centimetri rivestito LM511-E8 ad una densità di quattro sferoidi per centimetro quadrato e incubare per tre giorni. Dopo tre giorni, aspirare il mezzo, aggiungere il mezzo di differenziazione zero giorno e colturare le cellule per due giorni in un incubatore ipossico. Quindi, aspirare il giorno zero medium, aggiungere il secondo giorno mezzo di differenziazione e la cultura per altri due giorni.
Due giorni dopo, aspirare il mezzo e lavare le cellule due volte con PBS. Risciacquare le cellule con soluzione di dissociazione e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica. Dopo l'incubazione, dissociare le cellule riutilizzandole delicatamente in un EDTA millimolare.
Trasferire la sospensione in un tubo conico da 50 millilitri e centrifugare le cellule a 200 volte G per tre minuti. Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare con 300 microlitri di tampone di separazione magnetica. Aggiungere 100 microlitri di microperline cd34-positive alle cellule e mescolare delicatamente pipettando.
Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti, quindi utilizzare un filtro cellulare da 40 micrometri per filtrare la sospensione e separare le celle positive del CD34 utilizzando un separatore magnetico. Distribuire 0,5 millilitri di 5 microgrammi per soluzione di rivestimento di fibronecina millilitro in ogni pozzo di una piastra di coltura di 24 pozzetti e incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti. Nel frattempo, centrifugare le cellule cd34-positive ordinate a 200 volte G per tre minuti e rimescolare il pellet in un millilitro di mezzo EHT.
Determinare la densità cellulare praticabile con un contatore di celle e regolare la densità cellulare a 200.000 celle per millilitro aggiungendo il mezzo EHT. Aspirare e scartare la soluzione di rivestimento dai pozzali rivestiti con fibronectina e distribuire 0,5 millilitri di sospensione cellulare cd34-positiva in ogni pozzo. Incubare le cellule nell'incubatrice ipossica per una settimana.
Per raccogliere le celle galleggianti, trasferire il mezzo di coltura in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare a 200 volte G per tre minuti. Quindi aspira il supernatante. Per raccogliere le cellule aderenti, lavarle due volte con 0,5 millilitri di PBS e risciacquarle con tampone dissociante.
Aspirare il liquido in eccesso e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Rimorsi le cellule in un millilitro di tampone Facs e mescolare le cellule galleggianti e aderenti. Centrifugare le cellule miste a 200 volte G per tre minuti, quindi aspirare il supernatante e rimescolare le cellule in 50 microlitri di tampone Facs.
Diluire gli anticorpi anti-CD34 e anti-CD45 in 50 microlitri di tampone Facs;aggiungerli alle cellule e incubare le cellule per un'ora a temperatura ambiente al buio. Quindi, lavare le cellule due volte con PBS, centrifugando a 200 volte G per tre minuti dopo ogni lavaggio. Aspirare il supernatante e rimescolare le cellule in 0,5 millilitri di tampone Facs con 0,5 microgrammi per dappy millilitro.
Misurare l'espressione CD34 e CD45 in base alla citometria del flusso. Per raccogliere le cellule ematopoietiche, trasferire il mezzo di coltura in un tubo conico da 15 millilitri. Raccogliere le cellule rimanenti risciacquando delicatamente il pozzo due volte con PBS.
Centrifugare le cellule a 200 volte G per tre minuti, quindi aspirare il supernatante e rimescolare in un millilitro di mezzo EHT. Dopo aver contato le cellule, aggiungere 10.000 cellule a tre millilitri di mezzi distanziati di metilcellulosa, integrati con antibiotici, e utilizzare una siringa calibro 16 per mescolare cinque volte. Distribuire l'intera sospensione multimediale in ogni pozzo di una piastra a sei pozza.
Per mantenere le cellule umidi, aggiungere acqua o PBS ai pozzi vuoti sul piatto. Incubare le cellule per due settimane, assicurandosi di non disturbare il piatto poiché le colonie sono sensibili al movimento. Dopo due settimane, conta le colonie al microscopio.
Le cellule cambiano morfologicamente da cellule endoteliali a cellule ematopoietiche dopo la stimolazione con il cocktail ematopoietico. Le colonie di cellule ematopoietiche emergono nella coltura. Le cellule progenitrici ematopoietiche esprimono CD34 e CD45, quindi la citometria a flusso viene utilizzata per confermare la presenza di colonie di cellule ematopoietiche analizzando l'espressione di CD34 e CD45.
Un test di unità di formazione di colonie ha dimostrato la generazione di granulociti o colonie di macrofagi dalle cellule progenitrici ematopoietiche positive e CD45 positive. Si stima che il numero di colonie sia di 38 unità di formazione di colonie per 10.000 cellule. I passaggi più cruciali sono il conteggio degli sferoidi PSC.
Abbiamo scoperto che la metrica di superficie è il fattore più deterministico nell'efficienza di questo protocollo. Questa procedura può essere seguita da una produzione preconfezionata di cellule inergiche come cellule naturali e macrofagi. Questa piattaforma consente ai ricercatori di esplorare i principali fattori deterministici nello sviluppo ematopoietico umano.
