Nous offrons de produire des cellules sanguines à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Le principal avantage de cette technique est que nous obtenons des rendements cohérents et précis de cellules endothéliales hémogéniques. Nous nous attendons à ce que notre plate-forme permete de vastes applications dans la surveillance des maladies et le dépistage des composés thérapeutiques.
Cette technique est particulièrement bénéfique pour la recherche en hématologie et immunologie. La méthode peut être appliquée à l’intervention génétique ou à l’édition génétique des cellules sanguines humaines. Il permet une induction facile des vecteurs dans les cellules endothéliales hémogéniques.
Le point le plus crucial est le revêtement LM511-E8 pour taper les colonies psc. Nous ne recommandons pas de sauter le revêtement ou de remplacer par une autre matrice. Les démonstrations visuelles sont importantes parce que nous voulons montrer comment rincer les cellules avec un tampon de dissociation et comment enduire les plaques de LM511-E8.
Faire croître les cellules souches pluripotentes humaines ou les HPSC à entre 70 et 80% de confluence sur une plaque de six puits recouverte de LM511-E8 dans le milieu mTeSR1. Quatre jours avant l’induction hémogénique, aspirer le milieu et laver deux fois avec PBS. Rincez les cellules avec une solution de dissociation et incubez à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.
Resuspendez les cellules dans le milieu d’entretien psc et transférez la suspension dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Centrifuger les cellules à 200 fois G pendant trois minutes. Aspirer le supernatant, et resuspendre les cellules dans le milieu de placage PSC.
Plaquez la suspension de la CFP selon les instructions manuscrites sur un récipient en plastique microfabriqué et incubez pendant la nuit. Trois jours avant l’induction hémogénique, pipette doucement les sphéroïdes psc dans un tube conique de 15 millilitres et les laisser pendant deux minutes à température ambiante pour précipiter par gravité. Aspirer le supernatant et resuspendre les sphéroïdes dans le milieu de placage sphéroïde.
Répartir la suspension dans un plat de culture de 10 centimètres recouvert de LM511-E8 à une densité de quatre sphéroïdes par centimètre carré et incuber pendant trois jours. Après trois jours, aspirer le milieu, ajouter le jour zéro milieu de différenciation, et la culture des cellules pendant deux jours dans un incubateur hypoxique. Ensuite, aspirez le milieu jour zéro, ajouter le jour deux moyen de différenciation, et la culture pour un autre deux jours.
Deux jours plus tard, aspirer le milieu et laver les cellules deux fois avec PBS. Rincer les cellules avec une solution de dissociation et incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Après l’incubation, dissocier les cellules en les réutilisant doucement en un millimolaire EDTA.
Transférer la suspension dans un tube conique de 50 millilitres et centrifuger les cellules à 200 fois G pendant trois minutes. Aspirez le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire avec 300 microlitres de tampon de séparation magnétique. Ajouter 100 microlitres de microbilles cd34 positives aux cellules, et mélanger délicatement par pipetting.
Incuber à température ambiante pendant 30 minutes, puis utiliser une passoire à cellules de 40 micromètres pour forcer la suspension et séparer les cellules CD34 positives à l’aide d’un séparateur magnétique. Distribuez 0,5 millilitres de 5 microgrammes par solution de revêtement de fibronectine millilitre dans chaque puits d’une plaque de culture de puits de 24 puits, et incubez la plaque à température ambiante pendant 30 minutes. Pendant ce temps, centrifugez les cellules CD34-positives triées à 200 fois G pendant trois minutes, et réutilisez la pastille en un millilitre de milieu EHT.
Déterminez la densité cellulaire viable avec un compteur cellulaire, et ajustez la densité cellulaire à 200 000 cellules par millilitre en ajoutant un milieu d’EHT. Aspirez et jetez la solution de revêtement des puits enduits de fibronectine, et distribuez 0,5 millilitres de suspension cellulaire CD34-positive dans chaque puits. Incuber les cellules dans l’incubateur hypoxique pendant une semaine.
Pour recueillir les cellules flottantes, transférer le milieu de culture à un tube conique de 15 millilitres et une centrifugeuse à 200 fois G pendant trois minutes. Puis aspirer le surnatant. Pour recueillir les cellules adhérentes, lavez-les deux fois avec 0,5 millilitres de PBS et rincez-les avec un tampon dissociant.
Aspirer le liquide excédentaire et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Resuspendez les cellules en un millilitre de tampon facs, et mélanger les cellules flottantes et adhérentes. Centrifuger les cellules mélangées à 200 fois G pendant trois minutes, puis aspirer le supernatant et resuspendre les cellules dans 50 microlitres de tampon Facs.
Diluer les anticorps anti-CD34 et anti-CD45 dans 50 microlitres de tampon Facs; les ajouter aux cellules et incuber les cellules pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité. Ensuite, lavez les cellules deux fois avec PBS, en centrifugant à 200 fois G pendant trois minutes après chaque lavage. Aspirer le supernatant et résusquer les cellules en 0,5 millilitres de tampon Facs avec 0,5 microgramme par millilitre dappy.
Mesurer l’expression CD34 et CD45 par cytométrie d’écoulement. Pour recueillir les cellules hématopoïétiques, transférez le milieu de culture à un tube conique de 15 millilitres. Recueillir les cellules restantes en rinçant doucement le puits deux fois avec PBS.
Centrifuger les cellules à 200 fois G pendant trois minutes, puis aspirer le supernatant et resuspendre en un millilitre de milieu EHT. Après avoir compté les cellules, ajouter 10 000 cellules à trois millilitres de méthylcellulose espacée, complétées par des antibiotiques, et utiliser une seringue de calibre 16 pour mélanger cinq fois. Distribuez toute la suspension des médias dans chaque puits d’une plaque de six puits.
Pour garder les cellules humides, ajouter de l’eau ou du PBS aux puits vides de la plaque. Incuber les cellules pendant deux semaines, en s’assurant de ne pas déranger le plat car les colonies sont sensibles au mouvement. Après deux semaines, comptez les colonies au microscope.
Les cellules changent morphologiquement des cellules endothéliales aux cellules hématopoïétiques lors de la stimulation avec le cocktail hématopoïétique. Des colonies de cellules hématopoïétiques émergent dans la culture. Les cellules progénitrices hématopoïétiques expriment le CD34 et le CD45, de sorte que la cytométrie de flux est utilisée pour confirmer la présence de colonies de cellules hématopoïétiques en analysant l’expression du CD34 et du CD45.
Un essai d’unité de formation de colonie a démontré la génération des granulocytes ou des colonies de macrophage des cellules progénitrices hématopoïétiques CD34-positives et CD45-positives. On a estimé que le nombre de colonies était de 38 unités de formation de colonies pour 10 000 cellules. Les étapes les plus cruciales sont le décompte des sphéroïdes psc.
Nous avons constaté que la mesure de surface est le facteur le plus déterminant dans l’efficacité de ce protocole. Cette procédure peut être suivie par la production sur le marché de cellules inergical telles que les cellules naturelles et les macrophages. Cette plate-forme permet aux chercheurs d’explorer les principaux facteurs déterministes dans le développement hématopoïétique humain.
