우리는 인간 다능성 줄기 세포에서 생성 혈액 세포를 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 우리가 혈우병 내피 세포의 일관되고 정확한 수율을 얻을 수 있다는 것입니다. 우리는 우리의 플랫폼이 치료 화합물에 대한 질병 모니터링 및 선별에 광범위한 응용 프로그램을 가능하게 할 것으로 기대합니다.
이 기술은 혈액학 및 면역학 연구에 특히 유익합니다. 이 방법은 인간 혈액 세포의 유전 적 개입 또는 유전자 편집에 적용 될 수있다. 그것은 혈우성 내피 세포에서 벡터의 쉬운 유도를 허용합니다.
가장 중요한 점은 PSC 콜로니타이핑을 위한 LM511-E8 코팅입니다. 코팅을 건너뛰거나 다른 매트릭스로 대체하지 않는 것이 좋습니다. 우리는 해리 버퍼와 함께 세포를 헹구는 방법과 LM511-E8로 플레이트를 코팅하는 방법을 보여주기 때문에 시각적 데모가 중요합니다.
mTeSR1 배지에서 LM511-E8 코팅 6웰 플레이트에서 인간 만능 줄기 세포 또는 hPSC를 70~80%로 성장시다. 혈진 유도 4 일 전에, 매체를 흡인 하 고 PBS와 함께 두 번 세척. 해리 용액으로 세포를 헹구고 섭씨 37도에서 15 분 동안 배양하십시오.
PSC 유지 보수 매체에서 세포를 다시 중단하고 서스펜션을 1.5 밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 이송한다. 세포를 3분 동안 200배 G로 원심분리합니다. 초퍼를 흡인하고 PSC 도금 배지에서 세포를 재일시 중단합니다.
원고 지시에 따라 PSC 서스펜션을 미세 가공 플라스틱 용기에 플레이트하고 하룻밤 동안 배양합니다. 혈우성 유도 3일 전에 PSC 구형 튜브를 15밀리리터 원추형 튜브로 부드럽게 피펫하고 실온에서 2분 동안 방치하여 중력에 침전시합니다. 슈퍼네티드를 흡인하고 스페로이드 도금 매체에서 스페로이드를 재중단합니다.
서스펜션을 LM511-E8 코팅 10센티미터 배양 접시에 평방 센티미터당 4개의 스페로이드밀도로 분배하고 3일 동안 배양합니다. 3 일 후, 배지를 흡인, 저산소 인큐베이터에서 2 일 동안 세포를 배양 제로 분화 배지를 추가합니다. 그런 다음, 하루 0 매체를 흡인하고, 2일째 분화 매체를 추가하고, 문화를 2일 더 넣습니다.
이틀 후, 매체를 흡인하고 PBS로 세포를 두 번 씻는다. 해리 용액으로 세포를 헹구고 37도에서 30 분 동안 배양하고 이산화탄소5 %를 사용하십시오. 인큐베이션 후, 부드럽게 하나의 밀리모어 EDTA에서 그들을 다시 중단하여 세포를 소양.
서스펜션을 50밀리리터 원내 튜브로 옮기고, 세포를 3분 동안 200회 G로 원심분리합니다. 체퍼를 흡인하고 자기 분리 버퍼의 300 마이크로 리터로 세포 펠릿을 재중단합니다. CD34 양성 마이크로비드 100마이크로리터를 세포에 넣고 파이펫팅으로 부드럽게 섞습니다.
실온에서 30분 동안 배양한 다음 40마이크로미터 셀 스트레이너를 사용하여 서스펜션을 변형시키고 자기 분리기를 사용하여 CD34 양성 세포를 분리합니다. 밀리리터 섬유넥틴 코팅 용액 당 5 마이크로그램의 0.5 밀리리터를 24개의 웰 배양 플레이트의 각 웰에 분배하고, 30분 동안 실온에서 플레이트를 배양한다. 한편, 정렬된 CD34 양성 세포를 3분 동안 200배 G로 선별하고, EHT 배지의 1밀리리터에서 펠릿을 재연한다.
세포 카운터를 사용하여 실행 가능한 세포 밀도를 결정하고, EHT 배지를 추가하여 밀리리터당 세포 밀도를 200, 000 세포로 조절한다. 섬유네틴 코팅 된 우물에서 코팅 용액을 흡면하고 폐기하고 CD34 양성 세포 현탁액의 0.5 밀리리터를 각 우물에 분배합니다. 1 주일 동안 저산소 인큐베이터에서 세포를 배양.
부동 세포를 수집하려면 배양 배지를 15 밀리리터 원내 형관으로 옮기고 원심분리기를 3분 동안 200회 G로 이송한다. 그런 다음 슈퍼 네티퍼를 흡인합니다. 부착 된 세포를 수집하려면 PBS의 0.5 밀리리터로 두 번 씻고 해리 버퍼로 헹구습니다.
잉여 액체를 흡인하고 5 분 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양하십시오. Facs 버퍼의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단하고 부동 및 부착 셀을 혼합합니다. 3 분 동안 혼합 된 세포를 200 배 G로 원심 분리 한 다음 슈퍼 나탄을 흡인하고 Facs 버퍼의 50 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단합니다.
팍스 버퍼의 50 마이크로리터에서 항 CD34 및 항 CD45 항체를 희석;세포에 추가하고 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 세포를 배양. 그런 다음 PBS로 셀을 두 번 씻고, 매 씻은 후 3 분 동안 200 회 G에서 원심 분리합니다. 슈퍼나티를 흡인시키고 0.5 밀리리터의 팩 버퍼에서 셀을 재연하여 밀리리터 당 0.5 마이크로그램을 사용할 수 있습니다.
유동 세포측정에 의해 CD34 및 CD45 발현을 측정합니다. 조혈 세포를 수집하려면 배양 배지를 15 밀리리터 원내 튜브로 이송한다. PBS로 우물을 두 번 부드럽게 헹구어 나머지 세포를 수집합니다.
3 분 동안 200 배 G에서 세포를 원심 분리 한 다음 슈퍼 나탄을 흡인하고 EHT 매체의 1 밀리리터에서 다시 중단합니다. 세포를 계산한 후, 10, 000 세포를 메틸셀룰로오스 이격 된 매체의 3 밀리리터에 추가하고 항생제로 보충하고 16 게이지 주사기를 사용하여 5 번 혼합합니다. 전체 미디어 서스펜션을 6웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다.
세포를 촉촉하게 유지하려면 접시의 빈 우물에 물 이나 PBS를 추가하십시오. 2 주 동안 세포를 배양하여 식민지가 운동에 민감하기 때문에 접시를 방해하지 않도록하십시오. 2 주 후, 현미경으로 식민지를 계산합니다.
세포 형태학적으로 조혈 칵테일과 자극시 내피세포에서 조혈세포로 바뀝니다. 조혈 세포 식민지는 문화에 등장. 조혈 선조 세포는 CD34 및 CD45를 발현하므로 유동 세포측정은 CD34 및 CD45의 발현을 분석하여 조혈 세포 식민지의 존재를 확인하는 데 사용된다.
콜로니 형성 단위 분석은 CD34 양성 및 CD45 양성 조혈 선조 세포로부터 과립구 또는 대식파지 콜로니의 생성을 시연하였다. 콜로니 수는 10, 000 세포당 38개의 식민지 형성 단위로 추정되었다. 가장 중요한 단계는 PSC 스페로이드를 집계하는 것입니다.
표면 메트릭이 이 프로토콜의 효율성에서 가장 결정적인 요소라는 것을 발견했습니다. 이 절차는 자연적으로 발생하는 세포 및 대식세포와 같은 부적 세포의 기성 생산에 선행될 수 있습니다. 이 플랫폼을 통해 연구자들은 인간 조혈 개발의 주요 결정적 요인을 탐구할 수 있습니다.
