此方法可以检测称为 LINE-1 的逆转的活性。这些移动遗传元素会导致癌症基因组中新插入，从而导致基因组不稳定。这种基于PCR的技术的优点是，与高通量测序方法相比，它简单且经济高效。
我们在这里演示其在检测源自人类染色体22的TTC28基因内的 LINE-1 的重新插入的功用。LINE-1活性可作为恶性肿瘤或恶性前肿瘤的生物标志物，特别是在上皮肿瘤类型，如结肠癌或高档血清卵巢癌。除了 LINE-1 插入，此方法还可以检测其他基因组畸变，例如始终需要重新排列的 DNA 重新排列。
为了选择合适的限制酶，并设计反向底向器，首先，从 LINE-1 数据库（如 L1Base）下载 FASTA 格式的 TTC28 LINE-1 序列。TTC28 线路 1 的 L1Base ID 为 135。包括五个千基序列，侧翼为五个底数和三个底数，即 Line-1 序列的末尾。
将序列导出到字处理器。此处，Line-1 齿面序列以棕色字体注释，线-1 序列以灰色字体注释。将唯一标记确定为 TTC28 Line-1 三个底数下游的一个千基序列，并确定为聚亚二聚一酯信号预测工具之一，如 Polyadq 或 Dragon PolyA 斑点。
注释此千基窗口中的所有聚亚二化信号。TTC28 LINE-1 本身的弱聚亚化信号之间以粉红色突出显示，下游最强聚亚化信号之间的序列是此处以黄色突出显示的 LINE-1 的独特标记。要设计反向 PCR 底转，请将唯一的标记序列输入基于 Web 的底像设计工具，如 NCBI 的底像-BLAST 生成特定的 PCR 底项，请将产品长度参数降至最低，以显示底转对彼此接近。
选择适当的基因组数据库。当底像冲击的输出产生传统的PCR底转器彼此对时，使用底像对的反向补码函数执行反向PCR。设计间底向器，尽可能与东聚亚化信号对应。
我们屈尊了三个底像对，以青色和绿色突出显示，对应于 TTC28 LINE-1 独特标记中的三个强聚亚化信号。接下来，要选择合适的限制性酶，请使用基于 Web 的工具（如限制映射器）消化 LINE-1 序列及其五个基在二氧化硅的上下游侧翼。这将给出一个全面的限制性酶列表，消化这个原因，产生不同的限制片段。
选择在 LINE-1 的五个素端上游或接近 LINE-1 的五个素端（如果位于 LINE-1 本身）的五个素数切口的限制性酶。和三个主要卡下游从独特的标签。具有 LINE-1 序列的原生限制片段及其由选择性限制性酶制作的独特标记不应超过 12 千基，因为它可能不会被 PCR 有效地放大。
请注意，选择性限制性酶对DNA甲基化不敏感，应是热灭活的，并且应产生相互补充的粘性末端。为了演示长距离逆PCR，我们将使用SaCI限制酶，在DAZCTC站点切割DNA，以浅绿色突出显示。SacI 满足 TTC28 LINE-1 位点的所有条件，并生成 5，700 个基对的本机限制片段。
使用市售的DNA提取试剂盒从样品中提取基因组DNA，该试剂盒能够提取长距离逆PCR所需的高质量高分子DNA。在这里，我们提取了MCF7乳腺癌细胞系和正常人血使用制造指令的基因组DNA。使用荧光计测量DNA浓度。
一个人阿加罗斯凝胶上的1000纳米DNA，连同DNA分子量标记，以检查DNA的质量和数量。要制作圆形DNA模板，首先用合适的限制性酶消化DNA。在这里，我们使用Sa其消化MCF7和血液基因组DNA使消化反应混合根据文本协议。
通过轻拂管子和离心机短暂混合溶液。根据制造商的指示，在37摄氏度下孵育反应混合物一小时，然后进行热灭活。接下来，根据文本协议制作结扎反应主混合溶液，对消化的DNA进行自脱。
对于每次反应，将这种结扎反应主混合的30微升直接添加到前一步消化的DNA溶液的50微升中。通过轻拂管子并短暂地离心管混合溶液。在22摄氏度的热循环器中孵育这种反应混合物10分钟，最后在60摄氏度的热灭活步骤下再孵育10分钟。
此圆形 DNA 模板将用于后续反向 PCR 步骤。在热循环器中设置退火温度梯度，以按梯度 PCR 确定最佳底火退火温度。通过根据文本协议组合和混合所有组件，为 PCR 准备主混合。
为梯度中的每个退火温度设置一个反应。对于每次反应，分配19微升的主混合PCR管，并添加一个微升的圆形DNA模板，由血液基因组DNA生成。运行渐变 PCR 程序。
运行六微升PCR产品，在一个过程中用阿加罗斯凝胶加热，在一个不同的退火温度下加热。为了检测MCF7细胞系基因组中的DE novo TTC28 LINE-1逆转性活性，在从MCF-7细胞系生成的圆形DNA模板上使用反向底数对执行PCR。遵循与梯度 PCR 相同的说明，但这次将温度梯度替换为最佳退火温度（64 摄氏度）。
分析长距离逆PCR产品由阿加罗斯凝胶的结果。电泳后拍摄的阿加罗斯凝胶图像显示，从MCF7中提取的基因组DNA和血液样本具有高分子量，因此适合长距离反向PCR。电泳后拍摄的这张阿加罗斯凝胶图像显示，我们设计的逆质线对放大了所有退火温度下的正确圆形模板，如5千基和7千基DNA标记之间的剧烈跨度所观察到的梯度。
然而，在较低的温度下也观察到各种带子，表明底法特异性差，退火温度差。因此，对于此底向对，64 摄氏度是最佳退火温度。此阿加罗斯凝胶图像显示了从MCF7细胞系和正常血液中提取的DNA上执行长距离反向PCR后获得的PCR产品。
5，700 个基对的 PCF 产品（以星号标记）表示在其本机位置对应于 Line-1 的本机 PCR。这种原生PCR产品在MCF7和正常血液DNA中可见。De novo LINE-1逆转录和MCF7基因组可作为不同尺寸的PCR产品检测，以及阿加罗斯凝胶中的原生PCR产品。
采用单分子长读测序技术对长距离反向PCR产品进行测序，可以识别核密分辨率下的目标识别。虽然这种方法很繁琐，但长距离反向PCR产品的克隆和桑格测序也是可能的。在这段视频中，检测到22号染色体上的 LINE-1 的活性。
相同的工作流程可以调整，以监测其他 LINE-1 活跃在不同的肿瘤类型。
