Bu yöntem, LINE-1s adı verilen retrotranspozisyonların etkinliğini algılayabilir. Bu mobil genetik elementler kanser genomlarında de novo eklemelere neden olur ve bu nedenle genomik istikrarsızlığa katkıda bulunur. Bu PCR tabanlı tekniğin avantajı, yüksek iş yapma sıralama yaklaşımlarına kıyasla basit ve uygun maliyetli olmasıdır.
Burada insan kromozomu 22 üzerinde TTC28 geni içinde bir LINE-1 kaynaklanan de novo eklemeler tespit yarar göstermektedir. LINE-1 aktivitesi özellikle epitel tümörü tiplerinde, kolon kanseri veya yüksek dereceli seröz over kanseri gibi malignite veya pre-malignite için biyomarker olarak hizmet verebilir. LINE-1 eklemelerinin yanı sıra, bu yöntem dna yeniden düzenlemeleri gibi her zaman bir nedenden dolayı yeniden düzenlenmesi gereken diğer genomik sapmaları da tespit edebilir.
Uygun bir restriksiyon enzimi seçmek ve ters astarlar tasarlamak için Öncelikle TTC28 LINE-1 sırasını FASTA formatında L1Base gibi bir LINE-1 veritabanından indirin. TTC28 Line-1 için L1Base kimliği 135'tir. Line-1 dizisinin sonu, hem beş asal hem de üç asal olan beş asal diziyi çevreleyen beş kilobase dizisini ekleyin.
Sırayı bir sözcük işlemcisine dışa aktarın. Burada Line-1 yan sırası kahverengi yazı tipinde ve Line-1 dizilerinde gri yazı tipinde açıklamayapılır. TTC28 Line-1'in üç asal akışından aşağı doğru bir kilobase dizisine ve Polyadq veya Dragon PolyA Spotter gibi poliadenilasyon sinyali tahmin araçlarından birine benzersiz etiketi belirlemek için.
Bu bir kilobase penceresindeki tüm poliadenilasyon sinyalini açıklama. TTC28 LINE-1'in pembe renkte vurgulanan zayıf poliadenilasyon sinyali ile en güçlü poliadenilasyon sinyali arasındaki sekans, burada sarı renkte vurgulanan bu LINE-1'in benzersiz etiketidir. Ters PCR astarları tasarlamak için, ncbi'nin belirli PCR astarları üreten Primer-BLAST'ı gibi web tabanlı bir astar tasarım aracına benzersiz etiket sırasını girin, astar çiftlerin birbirine yakın olduğunu göstermek için ürün uzunluğu parametresini minimumda tutun.
Uygun genom veritabanını seçin. Primer Blast çıkışı birbirine bakan geleneksel PCR astarları üretirken, ters PCR gerçekleştirmek için astar çiftinin ters kompleman işlevini kullanın. Inter-tasarım astarlar, mümkün olduğunca doğu poliadenilasyon sinyalikarşılık gelen.
TTC28 LINE-1'in benzersiz etiketinde üç güçlü poliadenilasyon sinyaline karşılık gelen, teal ve yeşil renkte vurgulanan üç astar çiftini deigned ettik. Daha sonra, uygun bir kısıtlama enzimi seçmek için LINE-1 dizisini, RestrictionMapper gibi web tabanlı araçları kullanarak silikadaki beş kilobase upstream ve downstream yanları ile birlikte sindirin. Bu farklı kısıtlama parçaları üreten, bu nedenle sindirir restriksiyon enzimleri kapsamlı bir listesini verecektir.
LINE-1'in beş asal ucunun yukarısında veya LINE-1'in kendi içinde yse LINE-1'in beş asal ucuna doğru beş asal kesme yapan restriksiyon enzimlerini seçin. Ve benzersiz etiketten yukarı doğru üç ana kart. LINE-1 dizisi ve selektif restriksiyon enzimleri tarafından yapılan benzersiz etiketi ile yerli kısıtlama parçası, 12 kilobazdan uzun olmamalıdır, çünkü PCR tarafından verimli bir şekilde güçlendirilmeyebilir.
Seçici restriksiyon enzimlerinin DNA metilasyonuna duyarsız olacağını, ısı yalıtımlı olması ve birbirini tamamlayıcı yapışkan uçlar oluşturması gerektiğini unutmayın. Uzun mesafe ters PCR göstermek için, burada açık yeşil vurgulanan DAZCTC sitelerinde DNA keser SacI restriksiyon enzimi kullanacağız. SacI, TTC28 LINE-1 locus'taki tüm kriterleri karşılar ve 5, 700 baz çiftinden oluşan yerel bir kısıtlama parçası oluşturur.
Uzun mesafe ters PCR için gerekli kaliteli, yüksek moleküler DNA ayıklamak mümkün ticari olarak kullanılabilir DNA çıkarma kiti kullanarak örneklerden genomik DNA ayıklayın. Burada MCF7 meme kanseri hücre hattı ve normal insan kanı üretim talimatı kullanarak genomik DNA ayıkladı. Bir florometre kullanarak DNA konsantrasyonu ölçün.
100 000 nanogram DNA bir kişi agarose jel dna kalitesi ve miktarını kontrol etmek için bir DNA moleküler ağırlık marker yanında. Dairesel DNA şablonları yapmak için, ilk uygun kısıtlama enzimi ile DNA sindirmek. Burada SACI'yi MCF7'yi sindirmek için kullanıyoruz ve kan genomik DNA'sı metin protokolüne göre sindirim reaksiyonu karışımı nı yapıyoruz.
Tüpü ve santrifüjleri kısa bir süre hareket ettirerek çözeltiyi karıştırın. Reaksiyon karışımını bir saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve ardından üreticinin talimatına göre ısı inaktivasyonu. Daha sonra, sindirilmiş DNA'yı kendi kendine sıvılaştırmak için metin protokolüne göre bir ligasyon reaksiyonu ana karışımı çözeltisi yapın.
Her reaksiyon için, bu ligasyon reaksiyonu ana karışımından 30 mikrolitre ekleyin. Tüpü hareket ettirerek çözeltiyi karıştırın ve tüpü kısa bir süre santrifüj edin. Bu reaksiyon karışımını 22 derecede 22 santigrat derecede 10 dakika boyunca bir ısı döngüsünde kuluçkaya yatırın ve 10 dakika daha 60 santigrat derecede ısı inaktivasyon adımı ile bitirin.
Bu dairesel DNA şablonu sonraki ters PCR adımında kullanılacaktır. Degrade PCR ile en uygun astar annealing sıcaklığını belirlemek için termal döngüde bir annealing sıcaklık gradyanı ayarlayın. Tüm bileşenleri metin protokolüne göre birleştirerek ve karıştırarak PCR için bir ana karışım hazırlayın.
Degradedeki her bir annealing sıcaklığı için bir reaksiyon ayarlayın. Her reaksiyon için, ana karışımı PCR tüpler19 mikrolitre ayırmak ve dairesel DNA şablonu bir mikrolitre ekleyin, kan genomik DNA oluşturulan. Degrade PCR programını çalıştırın.
ALTı mikrolitre PCR ürünü çalıştırın, agarose jelde bir derste farklı tavlama sıcaklığında ısıtın. MCF7 hücre hattının genomundaki de novo TTC28 LINE-1 retrotranspozisyon aktivitesini saptamak için, MCF-7 hücre hattından oluşturulan dairesel DNA şablonlarında ters astar çifti kullanarak PCR gerçekleştirin. Degrade PCR için aynı talimatları izleyin, ancak bu sefer sıcaklık degradesini en uygun tavlama sıcaklığıyla değiştirin, bu da 64 santigrat derecedir.
Sonuçlar için agarose jel ile uzun mesafe ters PCR ürünleri analiz edin. Elektroforezlardan sonra çekilen bu agarose jel görüntüsü, MCF7'den alınan genomik DNA'yı gösterir ve kan örnekleri yüksek molekül ağırlığına sahiptir, bu da onu uzun mesafe ters PCR için uygun hale getirir. Elektroforezilerden sonra çekilen bu agarose jel görüntüsü, tasarladığımız ters astar çiftinin, 5 kilobase ile yedi kilobase DNA marker ilerlediği gibi degradedeki tüm sıcaklıklarda doğru dairesel şablonu güçlendirdiğini göstermektedir.
Ancak, çeşitli bantlar da düşük sıcaklıklarda gözlenir, kötü astar özgüllüğü ve kötü annealing sıcaklıkları gösteren. Böylece, bu astar çifti için, 64 santigrat derece optimum tavlama sıcaklığıdır. Bu agarose jel görüntü MCF7 hücre hattı ve normal kan çıkarılan DNA üzerine uzun mesafe ters PCR yaptıktan sonra elde edilen PCR ürün gösterir.
Yıldız işaretiyle işaretlenmiş 5,700 baz çiftilik bir PCF ürünü, yerel locus'ta Line-1'e karşılık gelen yerel PCR'yi temsil eder. Bu yerli PCR ürün hem MCF7 ve normal kan DNA görülebilir. De novo LINE-1 retrotranspozisyon ve MCF7 genom uğrama farklı boyutlarda PCR ürün olarak tespit edilebilir, agarose jel yerli PCR ürün ile birlikte.
Uzun mesafe ters PCR ürününün tek moleküler uzun okuma sıralama teknolojileri ile sıralanması, hedef tanımlamanın nükleer-sıkı çözünürlükte tanımlanmasına olanak sağlar. Hantal bir yaklaşım olmasına rağmen, uzun mesafe ters PCR ürün klonlama ve sanger sıralama da mümkündür. Bu videoda kromozom 22'de LINE-1 aktivitesi saptandı.
Aynı iş akışı farklı tümör tiplerinde aktif olan diğer LINE-1'leri izlemek için uyarlanabilir.
