이 메서드는 LINE-1s라는 소급 작업의 활동을 감지할 수 있습니다. 이러한 이동식 유전 적 요소는 암 게놈에 de novo 삽입을 유발하여 게놈 불안정에 기여합니다. 이 PCR 기반 기술의 장점은 고처리량 시퀀싱 접근 방식에 비해 간단하고 비용 효율적이라는 것입니다.
우리는 인간 염색체 22에 TTC28 유전자 안쪽에 LINE-1에서 유래한 de novo 삽입을 검출에 있는 그것의 유용성을 여기에서 여기에서 보여줍니다. LINE-1 활성은 결장암 또는 고급 세루 난소암과 같은 상피 종양 유형에서 특히 악성 또는 전 악성 종양에 대한 바이오마커역할을 할 수 있다. LINE-1 삽입 이외에, 이 방법은 항상 이유를 위해 재배열을 필요로 하는 DNA 재배열과 같은 그밖 게놈 수차를 검출할 수 있습니다.
적합한 제한 효소를 선택하고 역 프라이머를 설계하기 위해 먼저 L1Base와 같은 LINE-1 데이터베이스에서 FASTA 형식으로 TTC28 LINE-1 서열을 다운로드하십시오. TTC28 라인-1용 L1Base ID는 135입니다. 5킬로베이스 시퀀스를 포함, 모두 5 프라임과 세 프라임 측면, 라인-1 시퀀스의 끝.
시퀀스를 워드 프로세서로 내보냅니다. 여기서 Line-1 측면 시퀀스는 회색 글꼴의 갈색 글꼴 및 Line-1 시퀀스에 추가됩니다. 고유 태그를 TTC28 Line-1의 3개의 프라임의 1킬로베이스 서열 다운스트림으로 결정하고 폴리아드크 또는 드래곤 폴리아 스포터와 같은 폴리아데니션 신호 예측 도구 중 하나로 결정합니다.
이 1킬로베이스 창에서 모든 폴리아데닐레이션 신호를 음유합니다. TTC28 LINE-1의 자체 약한 폴리아데닐레이션 신호 사이의 시퀀스는 분홍색으로 강조되고 가장 강력한 폴리아데닐레이션 신호 다운스트림은 노란색으로 강조 표시된 이 LINE-1의 고유한 태그입니다. 역 PCR 프라이머를 설계하려면 특정 PCR 프라이머를 생성하는 NCBI의 프라이머 블라스트와 같은 웹 기반 프라이머 디자인 도구에 고유한 태그 시퀀스를 입력하려면 제품 길이 매개 변수를 최소한으로 유지하여 프라이머 쌍이 서로 가깝게 표시합니다.
적절한 게놈 데이터베이스를 선택합니다. 프라이머 블라스트의 출력이 서로 마주보고 기존의 PCR 프라이머를 생성하므로, 역 PCR을 수행하기 위해 프라이머 쌍에 대한 역 보완 기능을 사용합니다. 가능하면 동쪽 폴리아데닐레이션 신호에 대응하는 상호 설계 프라이머.
우리는 TTC28 LINE-1의 독특한 태그에 세 개의 강력한 폴리 아데닐레이션 신호에 대응하는 청록색과 녹색으로 강조 표시된 세 개의 프라이머 쌍을 훼손했습니다. 다음으로, 적합한 제한 효소를 선택하려면, Limit-1 서열을 소화하고, 5킬로베이스 업스트림 및 실리카의 다운스트림 측면과 함께 제한맵퍼와 같은 웹 기반 도구를 사용하여 사용한다. 이것은 다른 제한 단편을 생성, 이러한 이유를 소화 제한 효소의 포괄적 인 목록을 줄 것이다.
LINE-1 의 5 개의 프라임 엔드의 5 가지 프라임 업스트림또는 LINE-1 자체 내에있는 경우 LINE-1의 5 개의 프라임 엔드를 향해 절단하는 제한 효소를 선택하십시오. 그리고 독특한 태그에서 아래로 세 개의 프라임 카드. LINE-1 서열과 선택적 제한 효소에 의해 만들어진 고유한 태그를 사용하는 기본 제한 조각은 PCR에 의해 효율적으로 증폭되지 않을 수 있으므로 12킬로베이스보다 길지 않아야 합니다.
선택적 제한 효소는 DNA 메틸화에 민감하지 않을 것이며, 열이 비활성화될 수 있어야 하며, 서로 보완적인 끈적끈적한 끝을 생성해야 합니다. 장거리 역 PCR을 입증하기 위해, 우리는 밝은 녹색여기에 강조 DAZCTC 사이트에서 DNA를 잘라 SacI 제한 효소를 사용합니다. SacI는 TTC28 LINE-1 궤적의 모든 기준을 충족하고 5, 700 개의 기본 쌍의 기본 제한 조각을 생성합니다.
장거리 역 PCR에 필요한 고품질의 고품질의 고품질을 추출할 수 있는 시판가능한 DNA 추출 키트를 사용하여 샘플에서 게놈 DNA를 추출합니다. 여기서 우리는 MCF7 유방암 세포주 및 제조의 지시를 사용하여 일반적인 인간 혈액에서 게놈 DNA를 추출했습니다. 형광계를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다.
DNA 품질과 양을 확인하기 위해 DNA 분자량 마커와 함께 한 사람의 아가로즈 젤에 1000 나노 그램 DNA. 원형 DNA 템플릿을 만들려면 먼저 적절한 제한 효소로 DNA를 소화하십시오. 여기서 우리는 MCF7과 혈액 게놈 DNA를 소화하기 위하여 SacI를 사용하여 텍스트 프로토콜에 따라 소화 반응 혼합을 합니다.
튜브와 원심분리기를 짧게 가볍게 쓸어서 용액을 섞는다. 제조업체의 지시에 따라 한 시간 동안 섭씨 37도에서 반응 믹스를 배양한 다음 열 불활성화가 됩니다. 다음으로, 소화된 DNA를 자가 리게이트하는 텍스트 프로토콜에 따라 계칭 반응 마스터 믹스 솔루션을 만든다.
각 반응에 대해, 이전 단계에서 소화된 DNA 용액50마이크로리터에 직접 이 결찰 반응 마스터 믹스의 30 마이크로리터를 추가한다. 튜브를 가볍게 하고 튜브를 원심분리하여 용액을 짧게 섞습니다. 이 반응 믹스를 섭씨 22도에서 10분간 배양하여 섭씨 60도에서 10분간 열 비활성화 단계로 마무리합니다.
이 원형 DNA 템플릿은 후속 역 PCR 단계에서 사용됩니다. 열 사이클러에 어닐링 온도 그라데이션을 설정하여 그라데이션 PCR에 의한 최적의 프라이머 어닐링 온도를 결정합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 모든 구성 요소를 결합하고 혼합하여 PCR에 대한 마스터 믹스를 준비합니다.
그라데이션의 각 어닐링 온도에 대해 하나의 반응을 설정합니다. 각 반응에 대해, 마스터 믹스 PCR 튜브의 19 마이크로 리터를 할당하고 혈액 게놈 DNA에서 생성 된 원형 DNA 템플릿의 하나의 마이크로 리터를 추가합니다. 그라데이션 PCR 프로그램을 실행합니다.
PCR 제품의 6 마이크로리터를 실행, 아가로즈 젤에 한 코스에서 다른 어닐링 온도에서 가열. MCF7 세포주 게놈에서 드 노보 TTC28 LINE-1 소급 활성을 검출하려면 MCF-7 세포주에서 생성된 원형 DNA 템플릿에 역 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 수행합니다. 그라데이션 PCR과 동일한 지침을 따르지만, 이번에는 온도 그라데이션을 섭씨 64도인 최적의 어닐링 온도로 대체합니다.
결과에 대한 아가로즈 젤에 의해 장거리 역 PCR 제품을 분석한다. 전기전구 후 촬영한 이 아가로즈 젤 이미지는 MCF7에서 추출된 게놈 DNA를 나타내고 혈액 샘플은 분자량이 높기 때문에 장거리 역 PCR에 적합합니다. 전기전도 후 촬영한 이 아가로즈 젤 이미지는 우리가 설계한 역 프라이머 쌍이 5킬로베이스와 7킬로베이스 DNA 마커 사이의 강렬한 범위에 의해 관찰되는 그라데이션의 모든 어닐링 온도에서 올바른 원형 템플릿을 증폭시키는 것을 보여줍니다.
그러나, 다양한 밴드는 또한 낮은 온도에서 관찰, 가난한 프라이머 특이성과 가난한 어닐링 온도를 나타내는. 따라서,이 프라이머 쌍에 대 한, 64 섭씨 최적의 어닐링 온도. 이 아가로즈 젤 이미지는 MCF7 세포주 및 정상 혈액으로부터 추출된 DNA에 대해 장거리 역 PCR을 수행한 후 얻은 PCR 제품을 보여줍니다.
별표로 표시된 5, 700 개의 기본 쌍의 PCF 제품은 기본 궤적에서 Line-1에 해당하는 네이티브 PCR을 나타냅니다. 이 네이티브 PCR 제품은 MCF7 및 일반 혈액 DNA 모두에서 볼 수 있습니다. 드 노보 LINE-1 소급 및 MCF7 게놈은 아가로즈 젤의 네이티브 PCR 제품과 함께 다양한 크기의 PCR 제품으로 검출할 수 있습니다.
단일 분자 장거리 시퀀싱 기술로 장거리 역 PCR 제품을 시퀀싱하면 핵 이면에 대한 표적 식별을 식별할 수 있습니다. 번거로운 접근 방식이지만, 장거리 역 PCR 제품의 복제 및 sanger 시퀀싱도 가능합니다. 이 비디오에서는 염색체(22)에 LINE-1의 활동이 검출되었다.
동일한 워크플로우가 다른 종양 유형에서 활성화된 다른 LINE-1s를 모니터링하도록 조정할 수 있습니다.
