Este método pode detectar a atividade de retrotransposições chamadas LINE-1s. Esses elementos genéticos móveis causam inserções de novo em genomas cancerígenos e, assim, contribuem para a instabilidade genômica. A vantagem desta técnica baseada em PCR é que ela é simples e econômica em comparação com abordagens de sequenciamento de alto rendimento.
Demonstramos aqui sua utilidade na detecção de inserções de novo que se originam de uma LINHA-1 dentro do gene TTC28 no cromossomo humano 22. A atividade LINE-1 pode servir como biomarcador para a malignidade ou pré-malignidade especialmente em tipos de tumor epitelial, como câncer de cólon ou câncer de ovário soroso de alto grau. Além das inserções do LINE-1, este método pode detectar outras aberrações genômicas, como rearranjos de DNA que sempre precisam de rearranjo por uma razão.
A fim de selecionar uma enzima de restrição adequada e projetar primers inversos, primeiro, baixe a sequência TTC28 LINE-1 em formato FASTA a partir de um banco de dados LINE-1, como o L1Base. O L1Base ID para TTC28 Line-1 é 135. Inclua cinco quilobases sequência, flanqueando cinco primos e três primos, final da sequência line-1.
Exporte a sequência para um processador de texto. Aqui, a sequência de flanqueamento line-1 é anotada em fontes marrons e sequências line-1 em fonte cinza. Para determinar a tag única em uma sequência quilobase a jusante dos três primos da Linha 1 TTC28 e em uma das ferramentas de previsão de sinal de poliadenilação, como Polyadq ou Dragon PolyA Spotter.
Anote todo o sinal de poliadenilação nesta janela de uma quilobase. A sequência entre o próprio sinal fraco de poliadenilação do TTC28 LINE-1 destacado aqui em rosa e o sinal de poliadenilação mais forte a jusante é a marca única desta LINHA-1 destacada aqui em amarelo. Para projetar primers PCR inversos, digite a sequência de tags única em uma ferramenta de design de primer baseada na Web, como o Primer-BLAST da NCBI que gera primers pcr específicos, mantenha o parâmetro de comprimento do produto no mínimo para mostrar que os pares de primer estão próximos um do outro.
Selecione o banco de dados de genoma apropriado. Como a saída do Primer Blast gera primers convencionais de PCR voltados para o outro, use a função de complemento reverso para que o par de primer execute PCR inverso. Primers de design inter-, correspondentes ao sinal de poliadenilação leste sempre que possível.
Nós desenhamos três pares de primer, destacados em teal e verde, correspondendo a três forte sinal de poliadenilação na tag única de TTC28 LINE-1. Em seguida, para selecionar uma enzima de restrição adequada, digerir a sequência LINE-1, juntamente com seus flancos de cinco quilobases rio acima e rio abaixo em sílica usando ferramentas baseadas na Web, como RestrictionMapper. Isso dará uma lista abrangente de enzimas de restrição que digerem essa razão, gerando diferentes fragmentos de restrição.
Selecione enzimas de restrição que fazem um corte de cinco primes upstream do line-1 cinco prime end ou para a extremidade principal cinco da LINHA-1 se estiver dentro do próprio LINE-1. E um cartão de três prime rio abaixo a partir da tag única. O fragmento de restrição nativa com sequência LINE-1 e sua tag única feita por enzimas de restrição seletiva, não deve ser maior que 12 quilobases, pois pode não ser amplificado pelo PCR de forma eficiente.
Observe que as enzimas de restrição seletiva seriam insensíveis à metilação de DNA, deveriam ser inativas ao calor e deveriam gerar extremidades pegajosas que são complementares umas às outras. Para demonstrar PCR inverso de longa distância, usaremos enzima de restrição SacI que corta DNA em locais DAZCTC destacados aqui em verde claro. O SacI preenche todos os critérios no lócus TTC28 LINE-1 e gera um fragmento de restrição nativa de 5.700 pares de base.
Extrair DNA genômico de amostras usando kit de extração de DNA comercialmente disponível que é capaz de extrair dna molecular de boa qualidade e alta necessidade de PCR inversa de longa distância. Aqui extraímos DNA genômico da linha de células cancerígenas de mama MCF7 e sangue humano normal usando instruções de fabricação. Meça a concentração de DNA usando um fluorômetro.
100 nanogramas de DNA em uma pessoa agarose gel ao lado de um marcador de peso molecular de DNA para verificar a qualidade e quantidade de DNA. Para fazer modelos circulares de DNA, primeiro digerir o DNA com enzima de restrição adequada. Aqui usamos SacI para digerir MCF7 e DNA genômico de sangue Faça uma mistura de reação de digestão de acordo com o protocolo de texto.
Misture a solução apertando o tubo e centrífuga brevemente. Incubar a mistura de reação a 37 graus Celsius por uma hora seguida de inativação de calor, conforme instrução do fabricante. Em seguida, faça uma solução de mistura mestre de reação de ligadura de acordo com o protocolo de texto para auto-ligadurar o DNA digerido.
Para cada reação, adicione 30 microliters desta reação de ligadura mistura diretamente a 50 microliters de solução de DNA digerida da etapa anterior. Misture a solução apertando o tubo e centrifugar o tubo brevemente. Incubar esta mistura de reação em um cicloviário térmico a 22 graus Celsius por 10 minutos, terminando com um passo de inativação de calor a 60 graus Celsius por mais 10 minutos.
Este modelo de DNA circular será usado na etapa inversa do PCR subsequente. Coloque um gradiente de temperatura de ressarcimento em um cicloviário térmico para determinar a temperatura ideal de ressarcimento do primer por PCR gradiente. Prepare uma mistura mestre para o PCR combinando e misturando todos os componentes de acordo com o protocolo de texto.
Configure uma reação para cada temperatura de ressarcimento no gradiente. Para cada reação, aloque 19 microlitadores dos tubos de mix pcr mestre e adicione um microliter de modelo de DNA circular, gerado a partir do DNA genômico do sangue. Execute o programa de pcr de gradiente.
Execute seis microliters de produto PCR, aqueça-o a diferentes temperaturas de renascimento em um curso em gel de agarose. Para detectar a atividade de retrotransposição de novo TTC28 LINE-1 no genoma da linha celular MCF7, execute o PCR usando par de primer inverso em modelos de DNA circulares, gerados a partir da linha celular MCF-7. Siga as mesmas instruções do pcr gradiente, mas desta vez substituindo o gradiente de temperatura por uma temperatura de reclusão ideal, que é de 64 graus Celsius.
Analise os produtos PCR inversos de longa distância por gel de agarose para os resultados. Esta imagem de gel de agarose tirada após uma eletroforese mostra o DNA genômico extraído de MCF7 e amostras de sangue têm alto peso molecular, tornando-o adequado para PCR inverso de longa distância. Esta imagem de gel de agarose tirada após a eletroforeses mostra que o par de primer inverso que projetamos amplifica o modelo circular correto em todas as temperaturas de remassão no gradiente, como observado por um período intenso entre 5 quilobase e marcador de DNA de sete quilobases.
No entanto, várias bandas também são observadas em temperaturas mais baixas, indicando baixa especificidade de primer e baixas temperaturas de ressarcial. Assim, para este par de primer, 64 graus Celsius é a temperatura de ressarcial ideal. Esta imagem em gel de agarose mostra o produto PCR obtido após realizar PCR inverso de longa distância sobre o DNA extraído da linha celular MCF7 e sangue normal.
Um produto PCF de 5.700 pares de base, marcado por um asterisco, representam o PCR nativo correspondente à Linha-1 em seu lócus nativo. Este produto nativo de PCR é visível tanto no MCF7 quanto no DNA normal do sangue. De novo LINE-1 retrotransposição e genoma MCF7 é detectável como produto PCR de diferentes tamanhos, juntamente com produto PCR nativo no gel agarose.
Sequenciar o produto PCR inverso de longa distância por tecnologias de sequenciamento de leitura longa única pode permitir a identificação de alvos em uma resolução nuclear. Embora uma abordagem complicada, clonagem e sequenciamento sanger do produto PCR inverso de longa distância também é possível. Neste vídeo, foi detectada a atividade de um LINE-1 no cromossomo 22.
O mesmo fluxo de trabalho pode ser adaptado para monitorar outros LINE-1 que estão ativos em diferentes tipos de tumores.
