Ce protocole facilite l’observation directe de divers changements phénotypiques à un niveau unicellique et permet la surveillance continue de la localisation des protéines et du moment de l’expression des gènes. Le principal avantage de la microscopie par fluorescence est qu’il s’agit d’une méthode simple pour surveiller divers processus biologiques, tels que la division cellulaire et les changements de morphologie cellulaire dans les cellules vivantes. Assurez-vous d’accorder une attention particulière au protocole de préparation de l’échantillon et d’explorer le logiciel microscope pour être en mesure de localiser les paramètres et les options énumérés dans ce protocole.
Une représentation visuelle de ce protocole est essentielle car il permet aux utilisateurs de regarder et d’apprendre les étapes significatives de la technique comme ils ont mis en place leurs propres expériences. Commencez par étiqueter un aliquot de cinq à 50 microlitres de la culture cellulaire d’intérêt avec un colorant de colorant à coloration membranaire approprié et en ajoutant cinq microlitres des cellules bactériennes tachées sur un glissement de couverture sur le fond d’un plat de culture de fond de verre de 35 millilitres. Placez une dalle d’agarose de 11 millimètres de diamètre sur l’échantillon et appuyez doucement pour vous assurer que la dalle est plate contre le glissement du couvercle.
Ajouter ensuite environ cinq microlitres d’eau autour du glissement du couvercle pour empêcher le tampon agarose de sécher et permettre au plat de culture d’équilibrer à la température à l’intérieur de la chambre d’incubation d’un microscope à déconvolution haute résolution pendant 15 à 20 minutes. Pour l’image de l’échantillon, utilisez le bouton de mise au point d’ajustement grossier pour vous assurer que l’objectif est complètement abaissé avant d’initialiser le microscope dans le logiciel de microscope. Placez une goutte d’huile d’index réfractive de 1.517 dans l’objectif d’immersion d’huile 100x, et transférez le plat de fond en verre contenant l’échantillon dans le cercueil de logement en métal.
Faites glisser doucement le plat dans la pince de scène, et utilisez le bouton de réglage grossier pour augmenter l’objectif jusqu’à ce que l’huile entre en contact avec le fond de verre du plat. Utilisez l’oculaire et le bouton de réglage fin pour mettre l’échantillon au point, et passer en mode caméra. Dans le logiciel d’imagerie de la fenêtre Resolve 3D, sélectionnez l’icône Design/Run Experiment.
Une nouvelle boîte de dialogue s’intitulera Design/Run Experiment. Ouvrez les onglets Conception et Sectioning dans la boîte de dialogue pour définir le nombre de piles Z et l’épaisseur de l’échantillon. Pour mesurer l’épaisseur des cellules de l’échantillon, ajustez progressivement le plan Z à l’aide des flèches de haut en bas de la boîte de dialogue Resolve 3D, ce qui rend l’endroit où les cellules sont hors de discussion comme limites supérieures et inférieures pour l’acquisition d’image.
Après avoir ajusté la transmission en pourcentage de l’intensité lumineuse et la durée de l’exposition pour les différents canaux sélectionnés dans la boîte de dialogue Resolve 3D, cliquez sur Liste de points pour ouvrir la liste des points. Dans les onglets Conception et Time Lapse, sélectionnez la case à cocher Time Lapse et entrez les paramètres de laps de temps. Sélectionnez l’option liste point de visite et entrez les points à imager dans la boîte de texte, en séparant les points par virgules ou traits d’union pour des séquences complètes.
Modifiez ensuite les noms de fichiers et les emplacements de fichiers dans l’onglet Exécuter et sélectionnez Jouer dans la boîte de dialogue Begin Experiment pour démarrer l’expérience. À la fin de l’analyse, ouvrez les fichiers d’images RAW d’intérêt dans un programme de déconvolution approprié, et sélectionnez l’onglet Processus et Deconvolve. Effectuez n’importe quelle soustraction manuelle de bruit de fond et réglage de contraste de luminosité dans n’importe quel ou tous les canaux de longueur d’onde si nécessaire avant d’enregistrer l’image comme un fichier TIFF.
Pour la quantification de la longueur cellulaire, ouvrez les fichiers d’images décontvolutés du fabricant fourni par logiciel ou dans des logiciels d’imagerie libres, tels que ImageJ, et ouvrez l’onglet Outil. Sélectionnez ensuite mesurer les distances et cliquez à gauche sur les points de départ et de fin du fichier d’image désiré pour mesurer la longueur de la cellule. Pour la quantification des signaux fluorescents, sélectionnez Inspecteur des données.
Dessinez une case avec l’option Colonne/Ligne définie à la dimension spécifique d’intérêt, et sélectionnez la zone avec le signal à quantifier. L’ajout de xylose pour induire une souche GGS 8 entraîne un phénotype à six cellules. Alors que les commandes vectorielles vides semblent similaires aux cellules témoins cultivées en l’absence d’inducteur.
La surproduction de staphylocoque aureus GPSB perturbe la division cellulaire en B.subtilis telle que mesurée par la microscopie time lapse et la quantification de la longueur cellulaire. En outre, les modèles de localisation de FtsZ ou l’une des protéines associées à cette protéine peuvent être utilisés par un journaliste pour étudier et/ou identifier de nouveaux composés antimicrobiens grâce à l’imagerie par manque de temps et à la quantification de la longueur cellulaire. Assurez-vous d’utiliser une huile avec l’index réfractif approprié car l’indice réfractif peut changer en fonction de la température utilisée pour l’imagerie.
La déconvolution peut être effectuée si l’utilisateur souhaite supprimer le bruit hors foyer, et l’analyse des données impliquant la quantification du signal fluorescent et les mesures de longueur et de largeur des cellules peut également être effectuée.
