Dieses Protokoll erleichtert die direkte Beobachtung verschiedener phänotierter Veränderungen auf Einzelzellebene und ermöglicht die kontinuierliche Überwachung der Proteinlokalisierung und des Timings der Genexpression. Der Hauptvorteil der Fluoreszenzmikroskopie besteht darin, dass sie eine einfache Methode zur Überwachung verschiedener biologischer Prozesse ist, wie z. B. Zellteilung und Zellmorphologieveränderungen in lebenden Zellen. Achten Sie darauf, dem Probenvorbereitungsprotokoll besondere Aufmerksamkeit zu schenken und die Mikroskopsoftware zu untersuchen, um die in diesem Protokoll aufgeführten Einstellungen und Optionen zu finden.
Eine visuelle Darstellung dieses Protokolls ist von entscheidender Bedeutung, da es Benutzern ermöglicht, die wichtigen Schritte der Technik beim Einrichten ihrer eigenen Experimente zu beobachten und zu erlernen. Beginnen Sie mit der Kennzeichnung eines fünf bis 50-Mikroliter-Aliquotders der Zellkultur von Interesse mit einem geeigneten Membranfärbefarbstoff und fügen Sie fünf Mikroliter der gefärbten Bakterienzellen auf einen Deckelschlupf auf dem Boden einer 35-Milliliter-Glasbodenkulturschale hinzu. Legen Sie eine Agarose-Platte mit einem Durchmesser von 11 Millimetern über die Probe und tippen Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Platte flach gegenüber dem Deckelschlupf ist.
Fügen Sie dann etwa fünf Mikroliter Wasser um den Deckelschlupf, um zu verhindern, dass das Agarose-Pad trocknet und die Kulturschale auf die Temperatur in der Inkubationskammer eines hochauflösenden Dekonvolutionmikroskops für 15 bis 20 Minuten ausdemaiert. Um die Probe abzubilden, verwenden Sie den groben Einstellungsfokusknopf, um sicherzustellen, dass das Objektiv vollständig abgesenkt wird, bevor Sie das Mikroskop innerhalb der Mikroskopsoftware initialisieren. Legen Sie einen Tropfen von 1.517 Brechungsindexöl in das 100-fache Öl-Immersionsziel und übertragen Sie die Glasbodenschale mit der Probe in den Metallgehäusesarg.
Schieben Sie die Schale vorsichtig in die Bühnenklemme, und verwenden Sie den groben Verstellknopf, um das Ziel zu erhöhen, bis das Öl mit dem Glasboden der Schale in Kontakt tritt. Verwenden Sie das Okular und den Feinverstellknopf, um die Probe in den Fokus zu rücken, und wechseln Sie in den Kameramodus. Wählen Sie in der Bildverarbeitungssoftware im 3D-Fenster 3D auflösen das Symbol "Experiment entwerfen/ausführen" aus.
Ein neues Dialogfeld mit dem Titel Design/Ausführen von Experimenten wird angezeigt. Öffnen Sie die Registerkarten Entwurf und Schnitt im Dialogfeld, um die Anzahl der Z-Stacks und die Probendicke festzulegen. Um die Dicke der Zellen in der Stichprobe zu messen, passen Sie die Z-Ebene mit den Auf- und Abwärtspfeilen im Dialogfeld 3D auflösen inkrementell an, sodass die Zellen als obere und untere Grenzwerte für die Bildaufnahme aus dem Fokus verschwinden.
Nachdem Sie die prozentuale Übertragung der Lichtintensität und die Dauer der Belichtung für die einzelnen ausgewählten Kanäle im Dialogfeld 3D auflösen angepasst haben, klicken Sie auf Punkteliste, um die Punkteliste zu öffnen. Aktivieren Sie auf den Registerkarten Entwurf und Zeitraffer das Kontrollkästchen Zeitraffer und geben Sie die Zeitrafferparameter ein. Wählen Sie die Option "Listenbesuch" aus, und geben Sie die Punkte ein, die im Textfeld abgebildet werden sollen, indem Sie die Punkte durch Kommas oder Bindestriche für vollständige Sequenzen trennen.
Bearbeiten Sie dann Dateinamen und Dateispeicherorte auf der Registerkarte Ausführen, und wählen Sie Wiedergabe im Dialogfeld Experiment beginnen aus, um das Experiment zu starten. Öffnen Sie am Ende der Analyse die RAW-Bilddateien, die für ein entsprechendes Dekonvolutionprogramm von Interesse sind, und wählen Sie die Registerkarte Prozess und Deconvolve aus. Führen Sie alle manuellen Hintergrundrauschensubtraktion und Helligkeitskontrastanpassung in einem oder allen Wellenlängenkanälen nach Bedarf durch, bevor Sie das Bild als TIFF-Datei speichern.
Öffnen Sie zur Quantifizierung der Zelllänge die entschlüsselten Bilddateien im vom Hersteller bereitgestellten Software oder in freier Imaging-Software wie ImageJ, und öffnen Sie die Registerkarte Tool. Wählen Sie dann Entfernungen messen aus, und klicken Sie mit der linken Maustaste auf die Start- und Endpunkte in der gewünschten Bilddatei, um die Zellenlänge zu messen. Wählen Sie für die Fluoreszenzsignalquantifizierung Data Inspector aus.
Zeichnen Sie ein Feld mit der Option Spalte/Zeile auf die spezifische Dimension von Interesse, und wählen Sie den Bereich mit dem zu quantifizierenden Signal aus. Die Zugabe von Xylose zur Induzieren eines GGS 8-Stamms führt zu einem Phänotyp mit sechs Zellen. Während leere Vektorsteuerelemente den Kontrollzellen ähneln, die ohne Induktor gewachsen sind.
Die Überproduktion von Staph aureus gpsB stört die Zellteilung in B.subtilis, gemessen an der Zeitraffermikroskopie und der Zelllängenquantifizierung. Darüber hinaus können die Lokalisationsmuster von FtsZ oder eines der mit diesem Protein assoziierten Proteine als Reporter verwendet werden, um neuartige antimikrobielle Verbindungen durch die Zeitraffer-Bildgebung und zelllängenquantifization zu untersuchen und/oder zu identifizieren. Achten Sie darauf, ein Öl mit dem entsprechenden Brechungsindex zu verwenden, da sich der Brechungsindex je nach der für die Abbildung verwendeten Temperatur ändern kann.
Die Dekonvolution kann durchgeführt werden, wenn der Benutzer berührungslos rauschen möchte, und datenanalyse mit fluoreszierender Signalquantifizierung und Zelllängen- und Breitenmessungen können ebenfalls durchgeführt werden.
