Bu protokol, çeşitli henotik değişikliklerin tek hücre düzeyinde doğrudan gözlemini kolaylaştırır ve protein lokalizasyonu ve gen ekspresyonu zamanlamasının sürekli izlenmesini sağlar. Floresan mikroskobun en büyük avantajı, canlı hücrelerde hücre bölünmesi ve hücre morfolojisi değişiklikleri gibi çeşitli biyolojik süreçleri izlemek için basit bir yöntem olmasıdır. Örnek hazırlama protokolüne özellikle dikkat edin ve bu protokolde listelenen ayarları ve seçenekleri bulabilmek için mikroskop yazılımını araştırın.
Bu protokolün görsel bir gösterimi önemlidir, çünkü kullanıcıların kendi denemelerini kurarken tekniğin önemli adımlarını izlemelerine ve öğrenmelerine olanak tanır. Uygun bir membran boyama boya ile ilgi hücre kültürünün bir beş ila 50 mikrolitre aliquot etiketleme ve 35 mililitrelik cam alt kültür çanak altında bir kapak kayma üzerine lekeli bakteri hücrelerinin beş mikrolitre ekleyerek başlayın. Numunenin üzerine 11 milimetre çapında bir agarose levha yerleştirin ve levhanın kapak kaymasına karşı düz olduğundan emin olmak için hafifçe dokunun.
Daha sonra agarose pedin kurumasını önlemek için kapak kapağının etrafına yaklaşık beş mikrolitre su ekleyin ve kültür çanağının yüksek çözünürlüklü bir dekonvolution mikroskobunun kuluçka odasıiçindeki sıcaklığı 15-20 dakika boyunca dengelemesini bekleyin. Örneği görüntülemek için, mikroskop yazılımında mikroskopu başlatmadan önce hedefin tamamen düşürüleceğinden emin olmak için kaba ayar odak tonuzunu kullanın. 100x yağ daldırma hedefi içine 1.517 kırılma indisi yağ bir damla yerleştirin ve metal konut tabut içine örnek içeren cam alt çanak aktarın.
Yavaşça sahne kelepçeiçine çanak kaydırın ve yağ çanak cam alt ile temas edene kadar hedefi yükseltmek için kaba ayar topuz kullanın. Örneği odak lamak için merceğını ve ince ayar düğmesini kullanın ve Kamera Modu'na geçin. Çözüm3B penceresindeki görüntüleme yazılımında Deneme Tasarla/Çalıştır simgesini seçin.
Tasarım/Çalıştır Denemesi başlıklı yeni bir iletişim kutusu görüntülenir. Z yığınlarının sayısını ve örnek kalınlığını ayarlamak için iletişim kutusundaki Tasarım ve Kesit sekmelerini açın. Örnekteki hücrelerin kalınlığını ölçmek için, Çözüm3B iletişim kutusundaki yukarı ve aşağı okları kullanarak Z düzlemini kademeli olarak ayarlayın ve hücrelerin Görüntü Edinme için üst ve alt sınırlar olarak odak dışı gitmelerini sağlar.
Çözümleme 3B iletişim kutusunda ki tek tek seçilen kanallar için Işık Yoğunluğunun Yüzde İletimini ve Pozlama süresini ayarladıktan sonra Puan Listesini açmak için Puan Listesi'ni tıklatın. Tasarım ve Zaman Atlamalı sekmelerde, Zaman Atlamalı onay kutusunu seçin ve zaman atlama parametrelerini girin. Ziyaret Noktası listesini seçin ve tam diziler için noktaları virgülveya tirelere göre ayırarak metin kutusuna görüntülenecek noktaları girin.
Ardından Çalıştır sekmesinde dosya adlarını ve dosya konumlarını edin ve denemeyi başlatmak için Denemeyi Başlat iletişim kutusunda Oynat'ı seçin. Analizin sonunda, uygun bir deconvolution programında ilgi RAW görüntü dosyalarını açın ve İşlem sekmesi ni ve Deconvolve'u seçin. Görüntüyü TIFF dosyası olarak kaydetmeden önce, herhangi bir veya tüm dalga boyu kanallarında herhangi bir manuel arka plan gürültüsü çıkarma ve parlaklık kontrastı ayarlaması yapın.
Hücre uzunluğu niceliği için, üreticitarafından sağlanan yazılımdaki veya ImageJ gibi ücretsiz görüntüleme yazılımındaki deconvoluted görüntü dosyalarını açın ve Araç sekmesini açın. Ardından Ölçü Mesafeleri'ni seçin ve hücre uzunluğunu ölçmek için istenen resim dosyasındaki başlangıç ve bitiş noktalarını sol tıklatın. Floresan sinyal nicelliği için Veri Denetçisi'ni seçin.
İlginin belirli boyutuna ayarlanmış Sütun/Satır seçeneğiyle bir kutu çizin ve ölçülecek sinyalin bulunduğu alanı seçin. GGS 8 suşneden ksisoz eklenmesi altı hücreli fenotip sonuçları. Boş vektör kontrolleri indükleyici yokluğunda yetiştirilen hücreleri kontrol benzer görünürken.
Staph aureus gpsB aşırı üretimi zaman atlamalı mikroskopi ve hücre uzunluğu nicelleştirme ile ölçülen b.subtilis hücre bölünmesi bozar. Buna ek olarak, FtsZ veya bu protein ile ilişkili proteinlerden birinin lokalizasyon desenleri zaman atlamalı görüntüleme ve hücre uzunluğu nicelemesi yoluyla yeni antimikrobiyal bileşikleri incelemek ve/veya tanımlamak için bir muhabir kullanılabilir. Görüntüleme için kullanılan sıcaklığa bağlı olarak kırılma indisi değişebileceğinden, uygun kırılma indisi olan bir yağ kullandığınızdan emin olun.
Kullanıcı odak dışı gürültüyü kaldırmak isterse de dekonvolution yapılabilir ve floresan sinyal ölçümü ile hücre uzunluğu ve genişliği ölçümlerini içeren veri analizi de yapılabilir.
