يسهل هذا البروتوكول المراقبة المباشرة لمختلف التغيرات الظاهرية على مستوى خلية واحدة ويسمح بالمراقبة المستمرة لتوطين البروتين وتوقيت التعبير الجيني. الميزة الرئيسية للمجهر الفلوري هو أنه هو طريقة مباشرة لرصد العمليات البيولوجية المختلفة، مثل انقسام الخلايا وتغيرات مورفولوجيا الخلية في الخلايا الحية. تأكد من إيلاء اهتمام خاص لبروتوكول إعداد العينة واستكشاف برنامج المجهر لتكون قادرة على تحديد موقع الإعدادات والخيارات المذكورة في هذا البروتوكول.
يعد التمثيل المرئي لهذا البروتوكول أمرًا بالغ الأهمية لأنه يسمح للمستخدمين بمشاهدة وتعلم الخطوات الهامة لهذه التقنية أثناء إعدادهم تجاربهم الخاصة. تبدأ من خلال وضع العلامات على 5-50 ميكرولتر aliquot من ثقافة الخلية من الفائدة مع غشاء المناسبة تلطيخ صبغة وإضافة خمسة microliters من الخلايا البكتيرية الملون على زلة غطاء على الجزء السفلي من طبق ثقافة الزجاج القاع 35 ملليلتر. ضع لوح agarose قطره 11 ملليمترًا فوق العينة واضغط بلطف للتأكد من أن اللوح مسطح ضد زلة الغطاء.
ثم إضافة ما يقرب من خمسة ميكرولترات من الماء حول زلة الغطاء لمنع وسادة agarose من التجفيف والسماح للطبق الثقافة لتككيل درجة الحرارة داخل غرفة الحضانة من مجهر فك الاحتراق عالية الدقة لمدة 15 إلى 20 دقيقة. لصورة العينة، استخدم مقبض التركيز البؤري المتخف للتأكد من أن الهدف أقل بشكل كامل قبل تهيئة المجهر داخل برنامج المجهر. ضع قطرة من 1.517 زيت مؤشر انكسار في 100x النفط الغمر الهدف، ونقل طبق القاع الزجاجي التي تحتوي على عينة في نعش الإسكان المعدنية.
حرك الطبق بلطف إلى المشبك المرحلة، واستخدام مقبض التعديل الخشن لرفع الهدف حتى يجعل الزيت الاتصال مع الجزء السفلي من الزجاج من الطبق. استخدام العدسة ومقبض تعديل غرامة لجعل العينة في التركيز، والتحول إلى وضع الكاميرا. في برنامج التصوير الموجود في النافذة حل ثلاثي الأبعاد، حدد رمز "تصميم/تشغيل التجربة".
سيظهر مربع حوار جديد بعنوان "تجربة التصميم/التشغيل". افتح علامات التبويب "تصميم" و "قسم في مربع الحوار لتعيين عدد مكدسات Z و سمك العينة. لقياس سمك الخلايا في العينة، قم بضبط المستوى Z بشكل متزايد باستخدام الأسهم لأعلى ولأسفل في مربع الحوار Resolve 3D، مما يجعل الخلايا خارج التركيز كحد أقصى وأدنى للحصول على الصورة.
بعد ضبط نسبة الإرسال من كثافة الضوء ومدة التعرض للقنوات الفردية المحددة في مربع الحوار حل ثلاثي الأبعاد، انقر فوق قائمة النقاط لفتح قائمة النقاط. في علامات التبويب التصميم وفاصل الوقت، حدد خانة الاختيار الفاصل الزمني وأدخل معلمات الفاصل الزمني. حدد خيار قائمة نقطة الزيارة، وأدخل النقاط التي سيتم تصويرها في مربع النص، مع فصل النقاط بفواصل أو واصلات لتسلسلات كاملة.
ثم قم بتحرير أسماء الملفات ومواقع الملفات في علامة التبويب تشغيل وحدد تشغيل في مربع الحوار بدء التجربة لبدء التجربة. في نهاية التحليل، افتح ملفات الصور RAW ذات الاهتمام في برنامج فك التشفير المناسب، وحدد علامة التبويب عملية Deconvolve. تنفيذ أي عملية طرح تشويش في الخلفية وتعديل تباين السطوع اليدوي في أي قناة أو كل قنوات الطول الموجي حسب الضرورة قبل حفظ الصورة كملف TIFF.
بالنسبة إلى تحديد حجم طول الخلية، افتح ملفات الصور غير الملغية في البرامج الموردة من قبل الشركة المصنعة أو في برامج التصوير المجانية، مثل ImageJ، وافتح علامة التبويب Tool. ثم حدد قياس المسافات وانقر بزر الماوس الأيمن فوق نقطة البداية والنهاية على ملف الصورة المطلوب لقياس طول الخلية. بالنسبة إلى تحديد كمية الإشارة الفلورية، حدد Data Inspector.
ارسم مربع مع تعيين خيار العمود/الصف إلى البعد المحدد من الفائدة، وحدد المنطقة التي سيتم تحديدها كمياً. إضافة xylose للحث على GGS 8 نتائج سلالة في النمط الظاهري من ست خلايا. بينما عناصر تحكم ناقل فارغة تظهر مماثلة ل الخلايا التحكم التي تزرع في غياب مستحث.
الإفراط في إنتاج المكورات العنقودية aureus gpsB يعطل انقسام الخلايا في B.subtilis كما تقاس المجهر الفاصل الزمني وتكميم طول الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام أنماط توطين FtsZ أو أحد البروتينات المرتبطة بهذا البروتين مراسل لدراسة و/ أو تحديد المركبات المضادة للميكروبات الجديدة من خلال التصوير الفاصل الزمني وتكميم طول الخلية. تأكد من استخدام الزيت مع معامل الانكسار المناسب حيث قد يتغير مؤشر الانكسار اعتمادا على درجة الحرارة المستخدمة في التصوير.
يمكن إجراء إزالة التحلل إذا كان المستخدم يرغب في إزالة الضوضاء خارج التركيز ، ويمكن أيضًا إجراء تحليل البيانات الذي يتضمن تحديد كمية الإشارة الفلورية وقياسات طول الخلية وعرضها.
