Этот протокол облегчает прямое наблюдение за различными фенотипическими изменениями на одноклеточном уровне и позволяет непрерывно контролировать локализацию белка и сроки экспрессии генов. Основным преимуществом флуоресцентной микроскопии является то, что это простой метод мониторинга различных биологических процессов, таких как деление клеток и изменения морфологии клеток в живых клетках. Не забудьте обратить особое внимание на протокол подготовки образца и изучить программное обеспечение микроскопа, чтобы иметь возможность найти настройки и параметры, перечисленные в этом протоколе.
Визуальное представление этого протокола имеет решающее значение, поскольку позволяет пользователям смотреть и изучать значительные шаги техники, как они создали свои собственные эксперименты. Начните с маркировки от пяти до 50-микролитр aliquot клеточной культуры интереса с соответствующей мембраны окрашивания красителя и добавить пять микролитров окрашенных бактериальных клеток на крышку скольжения на дне 35-миллилитрового стекла нижней культуры блюдо. Поместите 11-миллиметровую плиту агарозы над образцом и аккуратно нажмите, чтобы убедиться, что плита плоская против крышки скольжения.
Затем добавьте около пяти микролитров воды вокруг крышки скольжения, чтобы предотвратить агарозы площадку от высыхания и позволяют культуре блюдо равномерный температуры внутри инкубациольной камеры высокого разрешения деконволюции микроскопа в течение 15 до 20 минут. Для изображения образца используйте ручку фокусировки грубой регулировки, чтобы убедиться, что цель полностью снижена до инициализации микроскопа в программном обеспечении микроскопа. Поместите падение 1,517 рефракционного индексного масла в цель 100-х нефтяного погружения и перенесите стеклянную нижнюю тарелку, содержащую образец, в металлический корпус гроба.
Аккуратно сдвиньте блюдо в сценический зажим и используйте ручку грубой регулировки, чтобы поднять цель до тех пор, пока масло не соестает со стеклянным дном блюда. Используйте окуляр и тонкую ручку регулировки, чтобы привести образец в фокус, и переключиться на режим камеры. В программном обеспечении для визуализации в окне Resolve 3D выберите значок Design/Run Experiment.
Появится новое диалоговое окно под названием Design/Run Experiment. Откройте вкладки «Дизайн и раздел» в диалоговом поле, чтобы установить количество стеков и толщину выборки. Чтобы измерить толщину ячеек в образце, постепенно отрегулируйте плоскость, используя стрелки вверх и вниз в диалоговом поле Resolve 3D, делая, где ячейки выходят из фокуса в качестве верхних и нижних пределов для приобретения изображения.
После корректировки процентной передачи интенсивности света и продолжительности экспозиции для отдельных выбранных каналов в диалоговом поле Resolve 3D нажмите Список точек, чтобы открыть список очков. В вкладых Design and Time Lapse выберите флажок Time Lapse и введите параметры промежуток времени. Выберите параметр списка Visit Point и введите точки, которые будут изображены в текстовом поле, разделяя точки на запятые или дефисы для полных последовательностей.
Затем отредактируйте имена файлов и местоположения файлов во вкладке Run и выберите Play в диалоговом поле Begin Experiment, чтобы начать эксперимент. В конце анализа откройте файлы изображений RAW, представляющие интерес для соответствующей программы деконволюции, и выберите вкладку Process и Deconvolve. Выполните любое ручное вычитание фонового шума и регулировку контрастности яркости в любом или всех длинах волновых каналов по мере необходимости перед сохранением изображения в качестве файла TIFF.
Для количественной оценки длины ячейки откройте файлы деконволюций изображений в поставляемом производителем программном обеспечении или в свободных программах визуализации, таких как ImageJ, и откройте вкладку Tool. Затем выберите Расстояние измерения и слева щелкните стартовые и конечные точки на нужном файле изображения для измерения длины ячейки. Для количественной оценки флуоресцентных сигналов выберите Data Inspector.
Нарисуйте коробку с опцией Column/Row, настроенной на определенное измерение интереса, и выберите область с сигналом, который будет количественно оценен. Добавление ксилозы для индуцирования штамма GGS 8 приводит к шестиклеточному фенотипу. В то время как пустые векторные элементы управления кажутся похожими на контрольные ячейки, выращенные в отсутствие индуктора.
Перепроизводство золотистого стафилококка gpsB нарушает деление клеток в B.subtilis, измеряемое микроскопией промежуток времени и количественной оценкой длины клеток. Кроме того, модели локализации Фтса или одного из белков, связанных с этим белком, могут быть использованы репортером для изучения и/или выявления новых противомикробных соединений с помощью визуализации промежуток времени и количественной оценки длины клеток. Обязательно используйте масло с соответствующим рефракционным индексом, так как рефракционный индекс может меняться в зависимости от температуры, используемой для визуализации.
Деконволюция может быть выполнена, если пользователь хочет удалить нефокусирующий шум, и анализ данных, включающий флуоресцентную количественную оценку сигнала и измерения длины и ширины ячейки, также может быть выполнен.
