心脏包含免疫细胞的异构组，在心脏炎症和修复中起着至关重要的作用。为了了解免疫细胞的异质性，并进一步洞察其功能，重要的是要有一种方法，将允许这些细胞从心脏恢复。这种技术可以帮助发现存在于健康或患病心脏中的免疫和非免疫细胞多样性。
这种技术有三个主要优点。首先，它是一个简单的单一工作流程，导致在三小时内生成各种细胞类型的单细胞悬浮液。其次，它导致活的免疫和非免疫细胞群的高恢复。
第三，这是一种非常通用的方法，也可以应用于其他物种的心脏组织。注意用于单一消化反应的组织量很重要。使用无菌剪刀，在冷盐水或HSSS中从左心室的腹壁或横向壁解剖组织标本。
小心地从标本中解剖出史诗般的脂肪和和弦肌腱。在无菌刀片或剪刀的帮助下，将组织块解剖成重约200毫克的碎片。对鼠标进行安乐死后，用锋利的剪刀打开胸腔。
使用钝的底片将心脏向上抬起。使用连接到 5 毫升注射器的 25 量针将心脏用冷 PBS 填充。直到心脏出现颜色发白。
取出心脏，放在冰上无菌的培养皿中。将200毫克的人体心脏组织块或穆林心脏放在无菌培养皿中。使用无菌刀片或剪刀将组织细小。
为了建立消化，在15毫升的圆锥管中，准备每根人体心脏组织块或一个乳氨酸心脏的三毫升的最终消化量，其浓度为每毫升450、60和60个单位。在管中加入2.5毫升DMEM。在清洁钳的帮助下，将细小的切碎的组织放入每个反应管中。
通过温和的漩涡混合良好。在37摄氏度的震动孵化器中消化一小时，以中低的搅拌速度。经过一个小时的消化，从培养箱中取出管子，放在冰上。
设置 50 毫升锥形管，顶部有 40 微米电池过滤器。用两毫升酶停用缓冲液将过滤器弄湿。接下来，通过在每个消化管中加入八毫升酶停用缓冲液来停用消化酶酶。
然后通过 40 微米细胞过滤器将产生的 13 毫升总混合物倒入 50 毫升锥形管中。将过滤过的样品在新鲜的 15 毫升锥形管中转移。在4摄氏度下以400倍g旋转样品6分钟。
丢弃上一杯，留下0.5毫升的介质。通过温和移液重新填充细胞颗粒，并加入一毫升的 ACK 解合缓冲液。温和旋转管，在室温下孵育五分钟，进行红血球解。
在 ACK 缓冲液中输入 5 分钟后，向样品中加入 9 毫升 DMEM。将盖子放回管子上，轻轻反转管子进行混合。通过 40 微米细胞过滤器过滤，并在 15 毫升锥形管中收集滤物。
将管子以400倍g离心6分钟，然后丢弃上流液。加入一毫升的 FACS 缓冲液，然后重新暂停颗粒。然后将其转移到1.5毫升微离心管。
再次以 400 次 g 离心，五分钟。丢弃上一杯，将颗粒重新在 100 微升的 FACS 缓冲液中。单细胞悬浮液现已准备好进行抗体染色。
在1至50次稀释时，将典型的人体抗体面板添加到心脏样本中。使用不同的抗体进行频闪细胞和穆林心脏巨噬细胞。在黑暗中4摄氏度下孵育30至40分钟。
加入一毫升的 FACS 缓冲液，轻轻涡流，以 400 次 g 离心，5 分钟。再次重复此洗涤步骤。然后将样品重新在 350 微升的 FACS 缓冲液中重新暂停，并添加 DAPI 以达到一微摩尔的最终浓度。
这些示例现已准备好进行 FACS 分析。在该协议中，实现了巨噬细胞与小鼠和人类心肌的分离。此图显示了未处理和加工的人类 LVAD 内核。
介绍了CCR2阴性、CCR2阳性人类巨噬细胞从人体肌膜和CD45阴性肌细胞的流量分选方案。Wright 染色 FACS 排序 CD45 阳性和 CD45 负细胞的图像显示完整的细胞膜，表明生存能力。从老鼠心脏中分拣巨噬细胞的浇注方案也取得了成功。
用于酶反应的组织的重量对于有效消化至关重要。对协议中所示的酶浓度使用不超过200毫克的组织。按照这种方法，可以培养细胞进行体外刺激测定。
细胞可以分类进行批量RNA测序或单细胞测序。这种方法在发现健康或患病人类心脏中以前未识别的巨噬细胞异质性方面已是一种宝贵的技术。使用这种方法，然后进行单细胞测序，研究正在发现各种免疫和非免疫细胞如何从患病的心脏和健康的心脏变化。
