הלב מכיל אוכלוסייה הטרוגנית של תאים חיסוניים המ ממלאים תפקידים מכריעים בדלקת לב, כמו גם תיקון. על מנת להבין את ההטרוגניות של תאי החיסון ולקבל תובנה נוספת על תפקודם, חשוב לקבל שיטה שתאפשר התאוששות של תאים אלה מהלב. טכניקה זו יכולה לעזור לחשוף את המגוון החיסוני, כמו גם תאים לא חיסוניים השוכן בלב בריא או חולה.
ישנם שלושה יתרונות עיקריים לטכניקה זו. ראשית, זוהי זרימת עבודה אחת פשוטה שמובילה לדור של השעיית תא בודד של סוגי תאים שונים בתוך שלוש שעות מהזמן. שנית, זה מוביל להתאוששות גבוהה של אוכלוסיות תאים חיסוניים ולא חיסוניים קיימא.
ושלישית, זוהי שיטה מאוד תכליתית והוא יכול להיות מיושם על רקמות לב גם מינים אחרים. חשוב לשים לב לכמות הרקמה המשמשת לתגובת עיכול אחת. השתמש מספריים סטריליים, לנתח דגימת רקמה מן הקיר משמש או בצדדים של החדר השמאלי מלוחים קרים או HBSS.
בזהירות לנתח את שומן מוקד וגיד chordae מן הדגימה. בעזרת להב סטרילי או מספריים, לנתח את נתחי הרקמה לחתיכות במשקל של כ 200 מיליגרם. לאחר המתת חום העכבר, לפתוח את חלל החזה בעזרת מספריים חדים.
השתמש בהמוסטטים קהים כדי להרים את הלב כלפי מעלה. לנטרל את הלב עם PBS קר באמצעות מחט מד 25 מחובר מזרק חמישה מיליליטר. מנווט עד הלב נראה blanched בצבע.
מוציאים את הלב ומ מניחים אותו בצלחת פטרי סטרילית על קרח. מניחים 200 מיליגרם של נתחי רקמת לב אנושית או לב מורין בצלחת פטרי סטרילית. יש לטחון טחון דק את הרקמה באמצעות להב סטרילי או מספריים.
כדי להגדיר עיכול, בצינור חרוט 15 מיליליטר, להכין נפח עיכול סופי של שלושה מיליליטר עבור כל נתח רקמת לב אנושית או לב מורין אחד עם אנזימים קולגן I, DNase I, ו hyaluronidase בריכוזים של 450, 60, ו 60 יחידות למיליליטר. הוסף 2.5 מיליליטר של DMEM לתוך הצינור. בעזרת מלקחיים נקיים, מניחים את הרקמה הטחון דק לתוך כל צינור תגובה.
מערבבים היטב על ידי מערבולת עדינה. לעכל במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד להגדיר למהירות תסיסה נמוכה עד בינונית. לאחר שעה של עיכול, מוציאים את הצינורות מהחממה ומ מניחים על קרח.
הגדר צינורות חרוטיים 50 מיליליטר עם מסננת תא 40 מיקרון על גבי. הרטב את המסננים עם שני מיליליטר של מאגר השבתת אנזימים. לאחר מכן, להשבית את אנזימי העיכול על ידי הוספת שמונה מיליליטר של מאגר ניתוב אנזימים לכל צינור עיכול.
ואז לשפוך את וכתוצאה מכך 13 מיליליטר של תערובת הכוללת דרך מסננת תא 40 מיקרון לתוך צינורות חרוט 50 מיליליטר. העבר את הדגימות המסוננות בחזרה בצינורות חרוט טריים של 15 מיליליטר. לסובב את הדגימות ב 400 פעמים g במשך שש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
השלך את העל-טבעי והשאיר 0.5 מיליליטר של מדיה. תוסיפו את גלולת התא על ידי צינורות עדינים והוסיפו מיליליטר אחד של מאגר תזת ACK. מערבולת עדינה הצינור והדהירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות כדי לבצע תותבת תאי דם אדומים.
לאחר חמש דקות במאגר ACK, הוסף 9 מיליליטר של DMEM לדגימה. שים את המכסה בחזרה על הצינורות בעדינות להפוך את הצינורות לערבב. מסננים דרך מסננת תאים של 40 מיקרון ואוסף את הסינון בצינורות חרוטיים 15 מיליליטר.
צנטריפוגה הצינורות ב 400 פעמים g במשך שש דקות ולהשליך את supernatant. הוסף מיליליטר אחד של מאגר FACS ולחץ מחדש על גלולה. ואז להעביר אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.
צנטריפוגה שוב ב 400 פעמים g במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והתקן מחדש את גלולת הכדור ב- 100 מיקרוליטרים של מאגר FACS. השעיית תא בודד מוכנה כעת להכתמת נוגדנים.
הוסף לוח נוגדנים אנושי טיפוסי לדגימות הלב בדילול של 1 עד 50. השתמש בנוגדנים שונים עבור תאים סטרומה מקרופאגים לב מורין. דגירה במשך 30 עד 40 דקות בארבע מעלות צלזיוס בחושך.
הוסף מיליליטר אחד של חיץ FACS, בעדינות מערבולת וצנטריפוגה ב 400 פעמים g במשך חמש דקות. חזור על שלב כביסה זה בפעם השנייה. לאחר מכן בצע שימוש חוזר בדגימה ב- 350 מיקרוליטרים של מאגר FACS והוסף DAPI כדי להגיע לריכוז סופי של מיקרומולר אחד.
הדגימות מוכנות כעת לניתוח FACS. בפרוטוקול זה הושג בידוד של מקרופאגים מעכבר ומ שריר הלב האנושי. איור זה מראה ליבת LVAD אנושית לא מעובדת ומעובדת.
ערכת gating עבור מיון זרימה של CCR2 שלילי CCR2 מקרופאגים אנושיים חיוביים מן שריר הלב האנושי, כמו גם עבור CD45 תאים סטרומה שליליים מן קרדיומיופתיה איסכמי אנושי הוצגו. התמונות של רייט מוכתם FACS ממוין CD45 חיובי CD45 תאים שליליים CD45 להראות קרום התא שלם המציין את הכדאיות. גם ערכת המיון של מקרופאגים מלב עכבר הצליחה.
משקל הרקמה המשמשת לתגובה אנזימטית הוא קריטי לעיכול יעיל. השתמש לא יותר מ 200 מיליגרם של רקמה עבור ריכוזי האנזים המצוין בפרוטוקול. בעקבות שיטה זו, תאים יכולים להיות מתורבתים עבור גירוי במבחנה assays.
ניתן למיין תאים עבור רצף RNA בצובר או רצף תא בודד. שיטה זו שימשה טכניקה שלא תסולא בפז בגילוי הטרוגניות המקרופאג' הבלתי מוכרת בעבר הקיימת בלב האדם הבריא או המחלה. בשיטה זו ואחריו רצף תאים בודדים, מחקרים מתנהלים כדי לחשוף כיצד תאים חיסוניים ולא חיסוניים שונים משתנים מלב חולה לעומת הלב הבריא.
