我们的协议针对鼠标模型进行了优化，并利用所有调查人员都随时可用的材料。此技术可应用于健康、疾病或基因改变的小鼠模型。我们的协议将使研究人员能够回答任何小鼠疾病或基因变异模型中有关心脏周利特生物学的任何问题。
这个程序将提供对心脏周利特生物学的洞察，并帮助我们了解它们对心脏平衡和血流动力学在健康和疾病的贡献。将麻醉鼠标放在上角位置，并将其前肢向下胶带。小心地打开胸腔，用25测量的蝴蝶针将下部大号大号开到牙中。
在右中庭做个刻痕。然后，用至少20毫升的每毫升肝素250单位，无钙镁的Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水，以每分钟两毫升的速度用可变流的维他拉泵对心脏进行缓冲。当干净的 PBS 从右侧的 atria 中出来时， 灌注就完成了。
切出主干处的心脏，并放入无冰冰的无钙DBS中。然后，将心脏转移到15乘15厘米的培养皿中。使用弹簧剪刀和细点钳将心脏切成小块，并有足够的酶溶液覆盖这些碎片。
现在，将碎片和溶液转移到50毫升锥形管中，用石蜡塑料薄膜密封。在120转/小时的轨道摇床上孵育37摄氏度，持续75分钟。胶原蛋白酶消化酶溶液后，通过100微米细胞过滤器将液体转化为新的50毫升管，留下足够的溶液，使碎片不会干涸。
使用细点钳子，从管子上拿出组织，在显微镜幻灯片上放置几块。然后，在两个显微镜幻灯片之间研磨组织以分解组织。用无酶培养基将幻灯片冲洗成新的 50 毫升锥形管。
重复此步骤，直到所有组织片段分离。将应变溶液和接地组织组合成一个管。通过 100 微米电池过滤器将由此产生的悬浮液应变到新的 50 毫升锥形管中。
将样品在220倍g和4摄氏度下离心5分钟。吸走上一个溶液，轻轻将细胞颗粒重新在含有DPBS和牛血清白蛋白的冷FACS染色缓冲液中。计算单元格，并使用单元格计数器检查可行性。
用含有DPBS和牛血清白蛋白的冷FACS染色缓冲液稀释细胞至每毫升100万个细胞。细胞现在准备被染色和排序。准备并标记所有控制装置和细胞样本的五毫升 FACS 管。
对于未污染的样品、荧光减去一个控制装置和等型匹配对照，每管的一毫升细胞均等。使用排序的剩余单元格。所有控制装置和样品可以同时准备和染色。
此外，准备和标记五毫升的 FACS 管，总共九个补偿控制，两种未污染的珠子加上七种不同的氟化物从标记面板。要优化荧光补偿控制，请将挤压小瓶中一滴补偿珠添加到每个管中。然后，在珠子上加入一微升抗体。
从标记面板对每个抗体重复。使用 FMO 控件优化由于光谱重叠而导致的背景染色。在FMO控制管中的细胞中，在1-100稀释时加入标记面板上的所有抗体，但排除一个抗体。
对每个抗体重复七个对等对。使用等型匹配控制抗体进行非特异性染色。在等型匹配标记管中的细胞中，在1-100稀释时加入等型匹配控制抗体。
接下来，准备要排序的单元格。在新鲜分离的细胞中，在1至100稀释时加入抗体鸡尾酒。此外，在1-1000稀释时加入细胞活力染料。
通过脉冲涡旋大力混合补偿控制。在4摄氏度下孵育30分钟，不受光，但细胞活力珠除外，这些珠子可以在室温下保持，不受光的影响。轻轻地混合 FMO 控件、等型匹配控件和要按脉冲涡旋排序的单元格。
在4摄氏度下孵育30分钟，不受光线影响。在每个补偿控制、FMO 控制和等型控制中添加三毫升 FACS 染色缓冲液。在4摄氏度下以300倍g离心管5分钟。
吸走溶液，并在 400 微升的 FACS 染色缓冲液中重新暂停每个颗粒。补偿控件、FMO 控件和等值类型控件现在可以使用了。染色后，用 FACS 染色缓冲液在 4 摄氏度下以 300 倍 g 离心洗涤细胞，5 分钟。
吸走溶液，将FACS染色缓冲液中的细胞颗粒重新暂停至每毫升50万个细胞。使用具有 35 微米滤网顶部的新 FACS 管，将染色细胞样品移液到盖子上，并进行重力过滤，以获得单细胞悬浮液。继续冰上。
使用细胞分拣机净化细胞。运行单元分拣机上的未污染电池以设置电压并校正背景信号。一次运行一个单色补偿珠样本，以调整每个通道的电压，并调整正信号的闸门。
收集数据。使用软件通过计算补偿矩阵来计算光谱重叠。所有电压都准备就绪并设置。
一次运行一个等值控制。此数据可用于调整非特定绑定的门（如果有）。一次运行每个 FMO 示例一个。
调整每个通道的电压，以纠正由于多色面板而导致的光谱出血。在单元格分拣机中运行染色单元格样本。在15毫升锥形收集管中收集10毫升无酶培养基中的细胞。
使用以下浇注策略。首先，单细胞的门。然后，活细胞的门。
接下来，CD45 阴性细胞的门。CD34 和 CD31 阴性细胞的门。然后，NG2阳性细胞的门。
最后，CD146和CD140b阳性细胞的闸门。培养膜，在涂覆的24井板上，在无酶培养基中播种新鲜获得的细胞。培养细胞培养箱中的细胞，其温度为37摄氏度、5%的二氧化碳和95%的氧气。
在酶消化和分离整个心脏和FACS纯化细胞之前，细胞是一种粗糙的混合物，包含许多不同的细胞类型从心脏。在FACS纯化和培养后，细胞是同质的。它们是单核的，相当平坦，具有典型的红红花形态。
使用 FACS，细胞被纯化为均质。首先，根据前进和侧散射分布，将碎屑和双子组封闭。然后，死细胞被封闭，由于它们与染料的胺反应，产生比活细胞更大、更强烈的信号。
在活细胞中，造血细胞通过CD45阳性被封闭。为了进一步去除造血细胞和内皮细胞，CD34阳性和CD31阳性细胞被封闭。最后，NG2阳性和CD140b/CD146阳性细胞被选为血管外细胞，具有典型的周利特标记的表达。
与人脑的脑筋默特相比，这些细胞的形态相似。与小鼠和人类平滑肌细胞相比，细胞在通过免疫细胞化学对七段细胞的形态表貌特征不同，对百分细胞标记的形态或标记表达没有观察到的变化。同样，通过流式细胞对7号通道中环氧体的分析证实，种群仍然同质。
细胞生存能力对于获得良好的产量至关重要。采购期间保持组织冷，细胞染色期间保持细胞冷。此外，请确保每次酶溶液都新鲜地准备。
为确保培养后正确细胞的分离，用流动细胞学和免疫荧光染色来描述它们。这些细胞可用于与内皮细胞的共培养实验，用于功能障碍研究，以及分析，以研究其生物和生理功能和特征。心脏性肺功能在血管的完整性和稳定性中起着基础性作用，其功能障碍对全球心脏功能有重要影响。
利用我们的技术，研究人员可以探索心脏性呼吸机的治疗潜力。
