Kalp, kardiyak inflamasyonda ve onarımda önemli rol oynayan bağışıklık hücrelerinin heterojen popülasyonunu içerir. Bağışıklık hücrelerinin heterojenliğini anlamak ve işlevleri hakkında daha fazla bilgi edinmek için, bu hücrelerin kalpten kurtarılmasına olanak sağlayacak bir yönteme sahip olmak önemlidir. Bu teknik, sağlıklı veya hastalıklı bir kalpte bulunan bağışıklık yanı sıra bağışıklık dışı hücre çeşitliliğini ortaya çıkarmak yardımcı olabilir.
Bu tekniğin üç ana avantajı vardır. İlk olarak, üç saat içinde çeşitli hücre türlerinin tek hücreli süspansiyon nesil yol açan basit bir tek iş akışı. İkincisi, canlı bağışıklık ve immün olmayan hücre popülasyonlarının yüksek iyileşme yol açar.
Ve üçüncü olarak, çok yönlü bir yöntemdir ve diğer türlerdeki kalp dokularına da uygulanabilir. Tek bir sindirim reaksiyonu için kullanılan doku miktarına dikkat önemlidir. Soğuk tuzlu veya HBSS sol ventrikül apikal veya lateral duvardan steril makas, diseksiyon doku örneği kullanın.
Dikkatle epikardiyal yağ ve kordatenin tendineae örnekten dışarı incelemek. Steril bir bıçak veya makas yardımıyla, yaklaşık 200 miligram ağırlığında parçalar halinde doku parçaları incelemek. Fareyi ötenazi yaptıktan sonra, keskin makas yardımıyla göğüs boşluğunu açın.
Kalbi yukarı kaldırmak için künt hemostatlar kullanın. Beş mililitrelik şırıngaya bağlı 25 kalibrelik bir iğne kullanarak kalbi soğuk PBS ile perfüzyon yapın. Kalp renkli görünene kadar perfuse.
Kalbi çıkarın ve buz üzerinde steril bir Petri kabına yerleştirin. Steril petri kabına 200 miligram insan kardiyak doku parçaları veya murin kalbi yerleştirin. Steril bir bıçak veya makas kullanarak dokuyu ince ince doğrama.
Sindirim kurmak için, bir 15 mililitre konik tüp, her insan kardiyak doku yığını veya enzimler kollajenaz I, DNase I ve hyaluronidaz ile üç mililitre son bir sindirim hacmi hazırlamak 450, 60, ve mililitre başına 60 birim konsantrasyonlarda. Tüpe 2,5 mililitre DMEM ekleyin. Temiz forceps yardımıyla, her reaksiyon tüpü içine ince kıyılmış doku yerleştirin.
Nazik girdap ile iyice karıştırın. Bir saat boyunca 37 santigrat derece bir sallayarak inkübatör düşük ve orta ajitasyon hızı ayarlayın sindirin. Sindirim bir saat sonra, kuvöz tüpleri almak ve buz üzerinde yerleştirin.
50 mililitrelik konik tüpler ilerler ve üzerinde 40 mikron hücreli süzgeç bulunur. Filtreleri iki mililitre enzim devre dışı tamponile ısla. Daha sonra, her sindirim tüpüne sekiz mililitre enzim devre dışı bırakarak sindirim enzimlerini etkisiz hale getirin.
Daha sonra 50 mililitrekonik tüpler içine 40 mikron hücreli süzgeç ile toplam karışımın elde edilen 13 mililitre dökün. Filtrelenmiş numuneleri taze 15 mililitrelik konik tüplere aktarın. Örnekleri 400 kez g'de dört santigrat derecede altı dakika döndürün.
0,5 mililitre ortam bırakarak supernatant atın. Hücre peletini nazik pipetleme ile yeniden askıya alın ve bir mililitre ACK lysis tamponu ekleyin. Nazik tüp girdap ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübate kırmızı kan hücre lisis gerçekleştirmek için.
ACK arabelleğibeş dakika sonra, örnek için DMEM dokuz mililitre ekleyin. Tüplerin kapağını geri koyun ve tüpleri yavaşça karıştırın. Filtre 40 mikron hücreli süzgeç ile ve 15 mililitre konik tüpler filtrat toplamak.
Tüpleri 400 kez g'de altı dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. Bir mililitre FACS arabelleği ekleyin ve peleti yeniden askıya alın. Sonra 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Santrifüj tekrar 400 kez g beş dakika için. Supernatant atın ve FACS tampon 100 mikrolitre pelet resuspend. Tek hücreli süspansiyon antikor boyama için hazır.
Kalp örneklerine 1 ila 50 seyreltme de tipik bir insan antikor paneli ekleyin. Stromal hücreler ve murin kalp makrofajları için farklı antikorlar kullanın. Karanlıkta 4 santigrat derecede 30-40 dakika kuluçkaya yat.
Beş dakika boyunca 400 kez g facs tampon, hafifçe girdap ve santrifüj bir mililitre ekleyin. Bu yıkama adımLarını ikinci kez tekrarlayın. Daha sonra FACS tampon 350 mikrolitre örnek resuspend ve bir mikromolar son konsantrasyonulaşmak için DAPI ekleyin.
Numuneler artık FACS analizi için hazır. Bu protokolde makrofajların fare ve insan miyokardiyumundan izolasyonu sağlanmıştır. Bu rakam işlenmemiş ve işlenmiş insan LVAD çekirdeğini göstermektedir.
Insan miyokardiyumundan CCR2 negatif ve CCR2 pozitif insan makrofajlarının yanı sıra insan iskemik kardiyomiyopatisinden CD45 negatif stromal hücrelerin inakış sıralaması için gating şeması sunuldu. Wright lekeli FACS görüntüleri CD45 pozitif ve CD45 negatif hücrelerin canlılık gösteren bozulmamış hücre zarı göstermektedir. Makrofajları fare kalbinden sıralamak için gating şeması da başarılı oldu.
Enzimatik reaksiyon için kullanılan dokunun ağırlığı verimli sindirim için çok önemlidir. Protokolde belirtilen enzim konsantrasyonları için en fazla 200 miligram doku kullanın. Bu yöntemden sonra, hücreler in vitro stimülasyon tahlilleri için kültürlenebilir.
Hücreler toplu RNA sıralaması veya tek hücre sıralaması için sıralanabilir. Bu yöntem, sağlıklı veya hastalıklı insan kalbinde mevcut olan daha önce tanınmayan makrofaj heterojenliğini keşfetmede paha biçilmez bir teknik olarak hizmet vermiştir. Bu yöntemi kullanarak tek hücre dizilimi takip, çalışmalar çeşitli bağışıklık ve immün olmayan hücrelerin hastalıklı kalp karşı sağlıklı kalp nasıl değiştiğini ortaya çıkarmak için devam etmektedir.
