El corazón contiene población heterogénea de células inmunitarias que desempeñan un papel crucial en la inflamación cardíaca, así como la reparación. Con el fin de entender la heterogeneidad de las células inmunitarias y obtener más información sobre su función, es importante tener un método que permita la recuperación de estas células del corazón. Esta técnica puede ayudar a descubrir la diversidad celular inmune, así como no no inmune que reside en el corazón sano o enfermo.
Esta técnica tiene tres ventajas principales. En primer lugar, es un flujo de trabajo único simple que conduce a la generación de suspensión de una sola celda de varios tipos de celdas dentro de las tres horas de tiempo. En segundo lugar, conduce a una alta recuperación de poblaciones de células inmunes y no no inmúnticas viables.
Y en tercer lugar, es un método muy versátil y se puede aplicar a los tejidos del corazón en otras especies también. Prestar atención a la cantidad de tejido utilizado para una sola reacción de digestión es importante. Utilice tijeras estériles, diseccione la muestra de tejido de la pared apical o lateral del ventrículo izquierdo en solución salina fría o HBSS.
Diseccionar cuidadosamente la grasa epicardial y las tendineas cordae del espécimen. Con la ayuda de una cuchilla estéril o tijeras, disecciona los trozos de tejido en trozos que pesen aproximadamente 200 miligramos. Después de eutanasiar el ratón, abra la cavidad torácica con la ayuda de tijeras afiladas.
Usa hemostats contundentes para elevar el corazón hacia arriba. Perfuque el corazón con PBS frío utilizando una aguja de calibre 25 unida a una jeringa de cinco mililitros. Perfuse hasta que el corazón aparezca blanqueado en color.
Retire el corazón y colóquelo en un plato estéril de Petri sobre hielo. Coloque 200 miligramos de trozos de tejido cardíaco humano o corazón murino en una placa estéril de Petri. Picar finamente el tejido usando una cuchilla estéril o tijeras.
Para establecer digestiones, en un tubo cónico de 15 mililitros, prepare un volumen de digestión final de tres mililitros para cada trozo de tejido cardíaco humano o un corazón murino con enzimas colagenasa I, DNase I e hialuronidasa a concentraciones de 450, 60 y 60 unidades por mililitro. Añadir 2,5 mililitros de DMEM en el tubo. Con la ayuda de fórceps limpios, coloque el tejido finamente picado en cada tubo de reacción.
Mezclar bien por vórtices suaves. Digerir durante una hora a 37 grados centígrados en una incubadora de temblores a una velocidad de agitación baja a media. Después de una hora de digestión, saque los tubos de la incubadora y colóquelos en hielo.
Configure tubos cónicos de 50 mililitros con un colador celular de 40 micras en la parte superior. Humedezca los filtros con dos mililitros de tampón de desactivación de enzimas. A continuación, desactive las enzimas de digestión añadiendo ocho mililitros de tampón de desactivación de enzimas a cada tubo de digestión.
A continuación, vierta los 13 mililitros resultantes de la mezcla total a través del colador celular de 40 micras en los tubos cónicos de 50 mililitros. Transfiera las muestras filtradas en tubos cónicos frescos de 15 mililitros. Girar las muestras a 400 veces g durante seis minutos a cuatro grados centígrados.
Deseche el sobrenadante dejando 0,5 mililitros de medios. Resuspender el pellet celular por pipeteo suave y añadir un mililitro de tólomo de lelisis ACK. Suave girar el tubo e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos para realizar la lelisis de glóbulos rojos.
Después de cinco minutos en el búfer ACK, agregue nueve mililitros de DMEM a la muestra. Vuelva a colocar la tapa en los tubos e invierta suavemente los tubos para mezclar. Filtrar a través de un colador celular de 40 micras y recoger el filtrado en tubos cónicos de 15 mililitros.
Centrifugar los tubos a 400 g durante seis minutos y deseche el sobrenadante. Añadir un mililitro de tampón FACS y resuspend el pellet. A continuación, transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Centrifugar de nuevo a 400 veces g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet en 100 microlitros de tampón FACS. Una suspensión de una sola célula ya está lista para la tinción de anticuerpos.
Agregue un panel de anticuerpos humanos típico a las muestras del corazón de una a 50 dilución. Utilice diferentes anticuerpos para las células estromales y los macrófagos cardíacos murinos. Incubar durante 30 a 40 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad.
Añadir un mililitro de tampón FACS, vórtice suave y centrífuga a 400 veces g durante cinco minutos. Repita este paso de lavado una segunda vez. A continuación, resuspender la muestra en 350 microlitros de tampón FACS y añadir DAPI para alcanzar una concentración final de un micromolar.
Las muestras ya están listas para el análisis FACS. En este protocolo, se logró el aislamiento de macrófagos del ratón y del miocardio humano. Esta figura muestra el núcleo LVAD humano no procesado y procesado.
Se presentó el esquema de medición para la clasificación de flujo de macrófagos humanos CCR2 negativos y CCR2 positivos del miocardio humano, así como para células estromales negativas CD45 de cardiomiopatía isquémica humana. Las imágenes de las células CD45 positivas y CD45 teñidas de Wright muestran una membrana celular intacta que indica viabilidad. El esquema de gating para ordenar los macrófagos de un corazón de ratón también tuvo éxito.
El peso del tejido utilizado para la reacción enzimática es fundamental para una digestión eficiente. No utilice más de 200 miligramos de tejido para las concentraciones enzimáticas indicadas en el protocolo. Después de este método, las células se pueden cultivar para ensayos de estimulación in vitro.
Las células se pueden ordenar para la secuenciación de ARN a granel o la secuenciación de una sola célula. Este método ha servido como una técnica invaluable en el descubrimiento de la heterogeneidad de macrófagos previamente no reconocidos que está presente en el corazón humano sano o enfermo. Usando este método seguido de secuenciación de una sola célula, se están llevando a cabo estudios para descubrir cómo varias células inmunes y no no no- no+ nulas varían desde el corazón enfermo en comparación con el corazón sano.
