Сердце содержит неоднородную популяцию иммунных клеток, которые играют решающую роль в сердечном воспалении, а также в ремонте. Для того, чтобы понять неоднородность иммунных клеток и получить дальнейшее представление об их функции, важно иметь метод, который позволит для восстановления этих клеток из сердца. Этот метод может помочь раскрыть иммунной, а также неиммуне клеточного разнообразия, которое находится в здоровом или больном сердце.
Есть три основных преимущества этой техники. Во-первых, это простой рабочий процесс, который приводит к генерации одноклеточной подвески различных типов клеток в течение трех часов времени. Во-вторых, это приводит к высокому восстановлению жизнеспособных иммунных и неиммунных популяций клеток.
И в-третьих, это очень универсальный метод и может быть применен к тканям сердца в других видах, а также. Важно обращать внимание на количество тканей, используемых для одной реакции пищеварения. Используйте стерильные ножницы, рассекаете образец ткани из апической или боковой стенки левого желудочка в холодном солевом растворе или HBSS.
Тщательно вскрыть эпикардиальный жир и chordae tendineae из образца. С помощью стерильного лезвия или ножниц, вскрыть куски ткани на куски весом около 200 миллиграммов. После усыпания мыши откройте грудную полость с помощью острых ножниц.
Используйте тупые гемостаты, чтобы поднять сердце вверх. Perfuse сердце с холодным PBS с помощью 25 калибровочных иглы прилагается к пяти миллилитров шприц. Пронизыть, пока сердце не появится бланшированный цвет.
Удалите сердце и поместите его в стерильную чашку Петри на льду. Поместите 200 миллиграммов кусков сердечной ткани человека или муринового сердца в стерильную чашку Петри. Мелко фарш ткани с помощью стерильного лезвия или ножницы.
Чтобы настроить пищеварения, в 15 миллилитров конической трубки, подготовить окончательный объем пищеварения в три миллилитров для каждого человека сердечной ткани кусок или один мурин сердце с ферментами коллагеназы I, DNase I, и гиалуронидазы в концентрациях 450, 60 и 60 единиц на миллилитр. Добавьте в трубку 2,5 миллилитров DMEM. С помощью чистых типсов поместите мелко рубленую ткань в каждую реакционной трубку.
Хорошо перемешать нежным вихрем. Дайджест в течение одного часа при 37 градусах по Цельсию в трясущимся инкубаторе установлен на низкой и средней скорости возбуждения. После одного часа пищеварения вывихни трубки из инкубатора и поместите на лед.
Установите 50 миллилитров конических трубок с 40 микрон-клеточный ситечко на вершине. Влажные фильтры с двумя миллилитров фермента деактивации буфера. Затем деактивировать ферменты пищеварения, добавив восемь миллилитров фермента деактивации буфера для каждой трубки пищеварения.
Затем залить в результате 13 миллилитров общей смеси через 40 микрон клеток ситечко в 50 миллилитров конических труб. Перенесите отфильтрованные образцы обратно в свежие 15 миллилитровых конических трубок. Спин образцов на 400 раз g в течение шести минут при четырех градусах по Цельсию.
Откажитесь от супернатанта, оставляя 0,5 миллилитров мультимедиа. Resuspend гранулы клетки нежным pipetting и добавить один миллилитр буфера лиза ACK. Нежный вихрь трубки и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут для выполнения лиза красных кровяных телец.
После пяти минут в буфере ACK добавьте в образец девять миллилитров DMEM. Положите крышку обратно на трубы и осторожно инвертировать трубки для смешивания. Фильтр через 40 микрон клеток ситечко и собирать фильтрат в 15 миллилитров конических труб.
Центрифуга труб на 400 раз г в течение шести минут и отказаться от супернатанта. Добавьте один миллилитр буфера FACS и перерасходуйте гранулы. Затем перенесите его в 1,5 миллилитр микроцентрифуг трубки.
Центрифуга снова при 400 раз г в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и перерасходуйте гранулы в 100 микролитров буфера FACS. Одноклеточная подвеска теперь готова к окрашивания антител.
Добавьте типичную человеческую панель антител к образцам сердца при разбавлении от одного до 50. Используйте различные антитела для стромальных клеток и макрофагов сердца мурина. Инкубировать в течение 30 до 40 минут при четырех градусах по Цельсию в темноте.
Добавьте один миллилитр буфера FACS, аккуратно вихрь и центрифугу при 400 раз г в течение пяти минут. Повторите этот шаг стирки во второй раз. Затем повторно посовещение образца в 350 микролитров буфера FACS и добавить DAPI для достижения окончательной концентрации одного микромолара.
В настоящее время образцы готовы к анализу FACS. В этом протоколе была достигнута изоляция макрофагов от мыши и миокарда человека. На этом рисунке показано необработанного и обработанного ядра LVAD человека.
Была представлена схема сортировки потока отрицательных и CCR2 положительных человеческих макрофагов из миокарда человека, а также для CD45 отрицательных стромальных клеток из ишемической кардиомиопатии человека. Изображения Райт окрашенных FACS отсортированы CD45 положительные и CD45 отрицательные клетки показывают нетронутыми клеточной мембраны, указывающие на жизнеспособность. Схема вымывания макрофагов из сердца мыши также была успешной.
Вес ткани, используемой для энзиматической реакции, имеет решающее значение для эффективного пищеварения. Используйте не более 200 миллиграммов ткани для концентрации ферментов, указанных в протоколе. Следуя этому методу, клетки могут быть выуфсяты для анализа стимуляции in vitro.
Клетки могут быть отсортированы для массового секвенирования РНК или секвенирования одной ячейки. Этот метод послужил бесценным методом в открытии ранее непризнанной неоднородности макрофагов, которая присутствует в здоровом или больном человеческом сердце. Используя этот метод с последующим одноклеточным секвенированием, проводятся исследования, чтобы выяснить, как различные иммунные и неиммунические клетки варьируются от больного сердца по сравнению со здоровым сердцем.
