Düşük transfeksiyon verimliliği, proteinin primer nöronlarda nörit büyümesini nasıl yeniden aktive ettigini belirlemenin önünde önemli bir engeldir. Protokolümüz bu sorunu başarılı bir şekilde transfected hücreleri belirlemek için EGFP'nin birlikte transfeksiyonu ile aşmaktadır. EGFP'nin yüksek transfeksiyon oranı ve ilgi proteinleri, talın doğruluğunu sağlar.
Ve sonuç olarak, immünoresans boyama artık gereklidir. Nöral rejenerasyon sırasında neurite büyüme oluşur gibi, Bu yöntem beyin travması veya nörodejeneratif hastalıklarda hasarlı nöronal ağ geri için yeni hedeflerin belirlenmesi için uygulanabilir. İşleme başlamadan önce, 12 kuyu doku kültür plakasının her kuyusunun içine steril 18 milimetrelik dairesel bir kapak yerleştirin ve her coverslip'i milimetre başına beş mikrogram ile nemlendirilmiş 37 derece likantide en az bir saat boyunca Poli-D-Lizin çözeltisi ile kaplayın.
Kuluçka sonunda Poli-D-Lizin çözeltisini aspire edin ve kapakları steril suyla durulayın. Embriyonik gün 18, 10 santimetre Petri çanak içine zamanlanmış hamile Sprague Dawley sıçan hasat rahim yerleştirin ve rahim ve amniyotik kese açmak için küçük diseksiyon makas kullanın. Plasentayı çıkarmak için makas kullanın ve soğutulmuş PBS glikoz içeren yeni bir 10 santimetre Petri kabına bir bütün embriyo aktarmak için plasedik kullanın.
Kafatasının sagittal sütür boyunca kesmek için makas kullanın ve taze buz soğuk PBS glikoz içeren yeni bir 10 santimetre Petri çanak içine embriyonik beyin aktarmak için küçük bir düz spatula kullanın. İki numaralı beş cımbız ve bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, beyincik ve beyin sapından iki serebral hemisfer ayırın ve menenjler kaldırın. Sonra serebral hemisferlerden korteks izole ve taze buz soğuk PBS glikoz içeren 15 mililitrelik tüp korteks yerleştirin.
Birincil kortikal nöron kültürü için, bir sınıf II biyogüvenlik kabine, korteks yerçekimi ile beş dakika için dört derece santigrat yerleşmek için izin 0.05% tripsin EDTA ile PBS glikoz değiştirmeden önce. Nazik dokunarak karıştırın ve ek nazik her iki dakikada dokunarak 10 dakika boyunca 37 derece santigrat su banyosunda doku kuluçka. Kuluçka sonunda, bakım orta dört mililitre ile sindirim durdurmak ve nazik trituration ile doku ayrıştırmak için bir mililitre pipet kullanın.
Hücreleri santrifüj ile tortula çökün ve ikinci bir santrifüj için bir mililitre bakım ortamıiçinde peleti yeniden askıya alın. Sayım için bir mililitre taze bakım ortamının ikinci santrifüjünden sonra oluşan peleti yeniden askıya alın ve izole nöronların 12 kuyu plakasında ki bir kuyuda bir mililitre bakım ortamının bir mililitrelik konsantrasyonunda santimetre karesi olan dördüncü canlı hücreye kadar 6,5 kat 10'da plakalayın. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit iki gün sonra, seyreltik EGFP ve hedef protein plazmid DAA ve transfeksiyon reaktif iki ayrı 1.5 mililitre tüpler ve sonra onları karıştırın.
EGFP ile transfect hücreler kuyulara transfeksiyon karışımı ekleyerek inşa. 24 saat sonra hücreleri 37 santigrat derece PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika pbs%4 paraformaldehit ile düzeltin. Kuluçka sonunda, sabit hücreleri yıkama başına taze PBS ile üç kez yıkayın ve numune başına bir mikroskop cam kaydırağı üzerine en az hacimli floresan montaj ortamı ekleyin.
Daha sonra cam kaydıraklara bakan örneklerle kaplamalı kapakları montaj ortamına dikkatlice aktarın. Nötrit büyümesini görüntülemek için, epifloresan mikroskobun 40X hedefini seçin ve transfeksiyon başına en az 40 bozulmamış EGFP pozitif nörondan görüntüler yakalamak için başlat'ı tıklatın. Tüm nöritler görüntülendiğinde, NeuronJ eklentisi ile ImageJ yakalanan görüntüleri açın ve büyüme konisi ucuna hücre vücudundan her nöron en uzun nöronun uzun luğunu ölçmek.
Daha sonra hedeflenen proteinlerin nörit büyümesi üzerindeki etkisini belirlemek için yazılımla elde edilen verileri analiz edin. Sitokasin D, neurite outgrowth sinir büyüme faktörü ile tedavi nöronlarda geliştirilmiş ise doza bağımlı bir şekilde neurite uzantısı bastırır. Buna ek olarak, nöronal büyüme adaptörü protein FE65 önemli ölçüde transfected nöronlar ile karşılaştırıldığında iki kat neurite outgrowth uyarır.
Düşük transfeksiyon verimliliğine rağmen, immünoreskence analizi iki günlük hücre kültürünün %80'inden fazlasının EGFP ve FE65 ile başarılı bir şekilde transfeced olabileceğini ortaya koymaktadır. Fe65 ilk saat 12'de tespit edilirken eGFP ekspresyonu transfeksiyon sonrası altı saat içinde tespit edilir ve her iki sinyal de transfeksiyon sonrası yedi gün boyunca tespit edilir. Fe65 plazmid DNA farklı miktarlarda primer sıçan kortikal nöronların transfeksiyon FE65 plazmid 0 ila 0,5 mikrogram ile nisit uzantısı doza bağımlı bir artış ortaya koymaktadır.
Ancak plazmidin 0.5 veya bir mikrogramı ile transfekte olan nöronlarda büyümede anlamlı bir fark gözlenmez. Protokolü denerken, embriyonik beyinden uygun bölgeyi izole etmek önemlidir. Bu teknik aynı zamanda rejeneratif tıp için değerli araçlara sahip insan iPSC kaynaklı nöronlarda nöral büyüme çalışması için uygulanabilir.
