トランスフェクション効率の低さは、タンパク質が一次ニューロンの神経突起成長を再活性化する方法を決定する上で大きな障害です。私たちのプロトコルは、EGFPの共同トランスフェクションによってこの問題を克服し、正常にトランスフェクトされた細胞を同定します。EGFPの高い共同トランスフェクション速度と関心のあるタンパク質は、アッセイの精度を保証します。
その結果、免疫蛍光染色が必要になりました。神経再生中に神経突起の伸長が起こるので、この方法は、脳外傷または神経変性疾患における損傷した神経ネットワークを回復するための新しい標的の同定に適用することができる。手順を開始する前に、滅菌18ミリメートルの円形カバースリップを12のウェル組織培養プレートの各ウェルウェルに入れ、各カバースリップにポリD-リジン溶液を1ミリメートル当たり5マイクログラムでコーティングし、少なくとも1時間は加湿した37°Cのインキュベーターに入れます。
インキュベーションの終わりに、ポリ-D-リジン溶液を吸引し、滅菌水でカバーリップをすすいします。胚性の日に18日目に、時を取った妊娠中のスプレイグ・ドーリーラットから収穫した子宮を10センチメートルのペトリ皿に入れ、小さな解剖ハサミを使って子宮と羊膜嚢を開きます。はさみを使用して胎盤を取り除き、鉗子を使用して1つの胚全体を冷やしたPBSグルコースを含む新しい10センチメートルのペトリ皿に移します。
頭蓋骨の矢状縫合に沿って切断し、新鮮な氷冷PBSグルコースを含む新しい10センチメートルペトリ皿に胚脳を転送するために小さな平らなへらを使用するためにはさみを使用してください。2つのナンバー5ピンセットと解剖顕微鏡を使用して、小脳と脳幹から2つの大脳半球を分離し、髄液を取り除く。その後、大脳半球から皮質を分離し、新鮮な氷冷PBSグルコースを含む15ミリリットルのチューブに皮質を入れる。
原皮質ニューロン培養の場合、クラスIIバイオセーフティキャビネットでは、PBSグルコースを0.05%トリプシンEDTAに置き換える前に、摂氏4度で5分間重力で皮質を沈着させる。穏やかなタッピングと混ぜ、2分ごとに追加の穏やかなタッピングで10分間摂氏37度の水浴で組織をインキュベートします。インキュベーションの終わりに、4ミリリットルの維持培地で消化を止め、1ミリリットルのピペットを使用して穏やかなトリチュエーションで組織を解きほしい。
遠心分離によって細胞を沈め、2回目の遠心分離のために1ミリリットルの維持培地中のペレットを再懸濁する。2回目の遠心分離後に形成されたペレットをカウントするための新鮮な維持培地の1ミリリットルで再懸濁し、12ウェルプレートで1ミリリットルの維持培地で4センチメートル平方濃度の6.5倍の10倍の位置で単離されたニューロンをプレートする。摂氏37度と二酸化炭素5%で2日間後、EGFPを希釈し、タンパク質プラスミドのドナとトランスフェクション試薬を2つの別々の1.5ミリリットルチューブで混合します。
EGFPを用いて細胞をトランスフェクション構造に添加し、そのトランスフェクションミックスをウェルに添加します。24時間後、37°CのPBSで細胞を洗浄し、室温で暗闇の中で10分間PBSで4%パラホルムアルデヒドで固定します。インキュベーションの終わりに、固定細胞を洗浄ごとに新鮮なPBSで3回洗浄し、サンプル当たりの顕微鏡ガラススライド1枚に最小限の蛍光実装媒体を加えます。
次に、コーティングされたカバーリップを慎重に、ガラススライドに面したサンプルで取り付けメディアに移します。神経突起の成長を画像化するには、蛍光顕微鏡上で40Xの目的を選択し、トランスフェクションごとに少なくとも40の無傷のEGFP陽性ニューロンからの画像をキャプチャするために開始をクリックします。すべての神経突起が画像化されたら、キャプチャした画像をNeuronJプラグインでImageJで開き、細胞体から成長コーンの先端までの各ニューロンの最長の神経突起の長さを測定します。
次に、ソフトウェアで得られたデータを分析し、対象タンパク質が神経突起増殖に及ぼす影響を調べます。サイトカラシンDは、神経成長因子で治療されたニューロンにおいて神経突起の伸長が増強されている間、用量依存的に神経突起の延長を抑制する。さらに、ニューロン成長アダプタータンパク質FE65は、未感染ニューロンと比較して神経突起伸長を2倍に有意に刺激する。
低いトランスフェクション効率にもかかわらず、免疫蛍光分析は、2日間の細胞培養の80%以上がEGFPおよびFE65との共感染に成功することを明らかにした。EGFP発現はトランスフェクション後6時間で検出され、FE65は最初に12時間で検出され、両方の信号はトランスフェクション後最大7日間検出されます。FE65プラスミドDNAの異なる量を有する一次ラット皮質ニューロンのトランスフェクションは、FE65プラスミドの0〜0.5マイクログラムの神経突起拡張における用量依存的増加を明らかにする。
しかし、0.5または1マイクログラムのプラスミドをトランスフェクトしたニューロンでは、増殖に有意な差は認められない。プロトコルを試みる際には、胚性脳から適切な領域を分離することが重要である。また、再生医療に有用なツールを持つヒトiPSC由来ニューロンの神経成長の研究にも応用できる。
