A baixa eficiência de transfecção é um grande obstáculo para determinar como a proteína reativa o crescimento de neurite nos neurônios primários. Nosso protocolo supera esse problema por co-transfecção do EGFP para identificar células transfeccionadas com sucesso. A alta taxa de co-transfecção do EGFP e as proteínas de interesse garantem a precisão do ensaio.
E, consequentemente, a coloração da imunofluorescência é agora necessária. Como o crescimento da neurita ocorre durante a regeneração neural, este método pode ser aplicado à identificação de novos alvos para restaurar a rede neuronal danificada em traumas cerebrais ou doenças neurodegenerativas. Antes de iniciar o procedimento, coloque uma cobertura circular estéril de 18 milímetros em cada poço de uma placa de cultura de tecido de 12 poços e cubra cada mancha com cinco microgramas por milímetro de solução poli-D-lysina em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius por pelo menos uma hora.
No final da incubação, aspire a solução Poly-D-Lysine e enxágue as tampas com água estéril. No dia 18, coloque o útero colhido de um rato Sprague Dawley grávida em uma placa de Petri de 10 centímetros e use uma pequena tesoura de dissecação para abrir o útero e o saco amniótico. Use a tesoura para remover a placenta e use fórceps para transferir um embrião inteiro para uma nova placa de Petri de 10 centímetros contendo glicose PBS refrigerada.
Use a tesoura para cortar ao longo da sutura sagital do crânio e use uma pequena espátula plana para transferir o cérebro embrionário para uma nova placa de Petri de 10 centímetros contendo glicose PBS gelada fresca. Usando duas pinças número cinco e um microscópio de dissecção, separe os dois hemisférios cerebrais do cerebelo e tronco cerebral e remova as meninges. Em seguida, isole o córtex dos hemisférios cerebrais e coloque o córtex em um tubo de 15 mililitros contendo glicose PBS gelada fresca.
Para a cultura primária do neurônio cortical, em um armário de biossegurança classe II, permita que o córtex se instale por gravidade por cinco minutos a quatro graus Celsius antes de substituir a glicose PBS por 0,05% de trippsina EDTA. Misture com toques suaves e incubar o tecido em um banho de água de 37 graus Celsius por 10 minutos com toques suaves adicionais a cada dois minutos. No final da incubação, pare a digestão com quatro mililitros de meio de manutenção e use uma pipeta de um mililitro para dissociar o tecido com trituração suave.
Sedimentar as células por centrifugação e resuspensar a pelota em um mililitro de meio de manutenção para uma segunda centrifugação. Resuspenque a pelota formada após a segunda centrifugação em um mililitro de meio de manutenção fresco para contagem e emplaque os neurônios isolados a 6,5 vezes 10 às quartas células viáveis por cento centímetro de concentração quadrada em um mililitro de meio de manutenção por poço em uma placa de 12 poços. Após dois dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, diluir e atingir dNAs plasmídeos de proteína e reagente de transfecção em dois tubos separados de 1,5 mililitro e, em seguida, misturá-los juntos.
Transfete as células com construção EGFP adicionando a mistura de transfecção aos poços. Após 24 horas, lave as células com 37 graus Celsius PBS e fixe-as com 4% de paraformaldeído em PBS por 10 minutos no escuro à temperatura ambiente. No final da incubação, lave as células fixas três vezes com PBS fresco por lavagem e adicione um volume mínimo de fluorescência em meio de montagem em um deslizamento de vidro microscópio por amostra.
Em seguida, transfira cuidadosamente as tampas revestidas para a mídia de montagem com as amostras voltadas para as lâminas de vidro. Para imaginar o crescimento de neurita, selecione o objetivo 40X em um microscópio epifluorescente e clique para começar a capturar imagens de pelo menos 40 neurônios positivos EGFP intactos por transfecção. Quando todos os neuritas tiverem sido imagens, abra as imagens capturadas no ImageJ com o plugin NeuronJ e meça o comprimento do neurite mais longo de cada neurônio do corpo celular até a ponta do cone de crescimento.
Em seguida, analise os dados obtidos com o software para determinar o efeito das proteínas-alvo no crescimento de neurite. A citochalasina D suprime a extensão de neurite de forma dependente de dose, enquanto o crescimento da neurita é aumentado em neurônios tratados com fator de crescimento nervoso. Além disso, a proteína adaptadora de crescimento neuronal FE65 estimula significativamente o crescimento do neurite em duas vezes em comparação com neurônios não transtraídos.
Apesar de uma baixa eficiência de transfecção, a análise da imunofluorescência revela que mais de 80% de uma cultura celular de dois dias pode ser co-transfecida com sucesso com EGFP e FE65. A expressão EGFP é detectada em seis horas após a transfecção, enquanto o FE65 é detectado pela primeira vez na hora 12 e ambos os sinais são detectados por até sete dias após a transfecção. A transfecção de neurônios corticais primários de ratos com diferentes quantidades de DNA plasmídeo FE65 revela um aumento dependente de dose na extensão de neurite com 0 a 0,5 microgramas de plasmídeo FE65.
No entanto, não é observada diferença significativa no crescimento em neurônios transfectados com 0,5 ou um microgramas do plasmídeo. Ao tentar o protocolo, é importante isolar a região apropriada do cérebro embrionário. Esta técnica também pode ser aplicada ao estudo do crescimento neural em neurônios derivados do iPSC humano que possuem ferramentas valiosas para a medicina regenerativa.
