siRNA 电穿孔以在单纯疱疹病毒类型 1-感染单细胞衍生的丹突细胞中调制自噬

我们的协议描述了有效干扰树突状细胞HSV-1诱导自噬周转的方法。特别是，我们将基于抑制剂的策略与基于siRNA的策略进行比较，以在感染前阻断自噬。虽然基于抑制剂的自噬干扰包括潜在的和特定的非靶外效应，但我们开发的基于siRNA的策略更具有靶向特异性。

重要的是，这两种技术都不会影响疾病的成熟阶段。演示这个程序的将是佩特拉·穆尔-祖尔-祖布，一个技术员，和亚历山德拉·杜索恩，一个研究生，从我的实验室。首先收获未成熟的树突状细胞或 iDC，在粘附后的第 4 天从细胞培养瓶底部轻轻冲洗松散粘附的细胞。

向细胞中加入成熟鸡尾酒，生成成熟的树突状细胞或mDC。诱导成熟两天后，从细胞培养瓶底部冲洗mDC。重复冲洗两次，然后将 iDC 和 mDC 转移到其各自培养培养的 50 毫升管中。

通过离心收集细胞在300倍g五分钟。轻轻将细胞重新悬浮在每细胞培养瓶的 5 到 10 毫升 RPMI 1640 中，并将各自的直流悬浮液组合在一个管中。然后使用计数室量化细胞，确保在处理DC时避免温度变化。

将两百万 iDC 或 mDC 转移到两毫升管中，在 3，390 次 g 下离心 1-1/2 分钟，然后丢弃上光。轻轻重新暂停感染介质中的细胞。抑制自噬细胞体裂糖体降解途径，在感染前一小时将10微摩尔孢素-1或1微摩尔巴菲霉素A1添加到感染介质中。

添加 DMSO 以进行未经处理的控制，并在 37 摄氏度的加热块上孵育电池，并在 300 RPM 下摇晃。对于感染研究，接种与HSV-1病毒在两个感染的多重细胞。添加各自的MNT缓冲液量作为模拟控制，并在37摄氏度的加热块上孵育细胞，在震动下孵育一小时。

感染一小时后，通过离心收集细胞，以3，390次g1-1/2分钟，然后轻轻地吸气，并在DC介质中重新暂停细胞。种子模拟治疗和HSV-1感染细胞的最终浓度为100万细胞每毫升到六井板。感染后16至24小时，使用细胞刮刀或mDC通过冲洗，收集ICC，将细胞转移到1.5毫升的安全锁管中，并在3，390次g中收集，1-1/2分钟。

与井中的其余细胞重复收获和离心，然后用一毫升 PBS 洗涤颗粒一次，并在解菌混合物中大力重新暂停细胞。在37摄氏度下孵育样品10分钟，然后加热至95摄氏度10分钟。执行 SDS 页面和西部印迹分析，以验证 LC3B1 和 LC3B2、P62、ICP0 和 ICP5 以及 GAPDH 蛋白质水平。

在第3.5天坚持后，将1200万个ICC转移到一个50毫升的管子中，以300次g离心5分钟，然后丢弃上光。同时，执行流量细胞测量分析以监测成熟状态。在五毫升 Opti-MEM 中轻轻清洗 iDC，不带酚红色，以 300 倍 g 离心 5 分钟。

丢弃上一提液，在Opti-MEM的200微升中重新暂停细胞，将细胞浓度调整为每100微升600万细胞。将 75 个 FIP200 特异性或炒西RNA的皮球添加到 4 毫米电奎质中，并将 100 微升细胞悬浮液转移到各自的库维特中。使用电穿孔装置直接脉冲 iDC。

电穿孔后，将 iDC 转移到六孔板中，用新鲜预热直流培养物，以每毫升一百万个细胞的最终浓度播种细胞，并把它们放在培养箱中。48小时后，对电分 iDCs 的形态进行微观检查，然后用细胞刮刀采集细胞，然后将其转移到 15 毫升管中。用一毫升 PBS 和 0.1% EDTA 补充的洗孔，将溶液转移到相应的管中。

然后分裂每个siRNA条件的细胞，如手稿中所述。使用50万个细胞来评估成熟状态和细胞生存能力，使用100万个细胞进行西部印迹分析，以验证FIP200特异性击倒效率，并使用剩余的细胞进行HSV-1感染实验。通过流细胞学对生成的 iDC 和 mDC 进行表型分析，以排除与其他细胞类型的污染并验证其成熟状态。

这些细胞分别染色CD3和CD14抗体，以排除T细胞和单细胞污染。细胞被染色为CD11c，作为DC高度表达的通用标记。为了评估成熟状态，使用了CD80、CCR7、CD83和MHCII抗体，因为这些分子在成熟的DC上表达强烈。

荧光显微镜和流式细胞学用于确定与EGFP表达HSV-1的感染。强 GFP 信号表示几乎完全感染了 iDC 和 mDC。西方印迹分析用于确定斯帕廷-1或巴菲洛霉素A1是否抑制HSV-1感染细胞的自噬通量。

在 iDC 中，在没有 spautin-1 和巴菲霉素 A1 的情况下，P62 和 LC3B 表达的下降证明了自噬通量。相比之下，在没有孢子素-1的情况下，MDC的HSV-1感染不会影响P62表达，而spautin-1和BA1治疗导致LC3B-II的积累，这反映了自噬的诱导，但MDC自噬周转失败。通过 siRNA 电穿孔降低 FIP200 蛋白质水平也会导致 HSV-1 感染 iDCs 中自噬通量的显著减少。

这种基于siRNA的电穿孔方案用于抑制自噬，不影响细胞的生存能力、图像表型或在ICDC中建立HSV-1蛋白表达。我们的电穿孔协议提供机会，将不同的DNA或RNA物种提供到疾病和其他原发细胞类型。随后，可以进行各种分子、功能和感染分析。

基于siRNA的表达沉默策略在疾病中为探索任何感兴趣的蛋白质的功能铺平了道路，也结合了随后的功能分析。