Unser Protokoll beschreibt Methoden, um den HSV-1-induzierten autophagischen Umsatz in dendritischen Zellen effizient zu stören. Insbesondere vergleichen wir einen Inhibitor-basierten mit einer siRNA-basierten Strategie, um die Autophagie vor der Infektion zu blockieren. Während die inhibitorbasierte Interferenz mit der Autophagie potenzielle und spezifische Off-Target-Effekte umfasst, ist unsere entwickelte siRNA-basierte Strategie zielgerichteter.
Wichtig ist, dass beide vorgestellten Techniken die Reifestadien der Krankheit nicht beeinflussen. Die Technikerin Petra Muhl-Zurbes und die Abiturientin Alexandra Duthorn aus meinem Labor werden das Verfahren demonstrieren. Beginnen Sie mit der Ernte unreifer dendritischer Zellen oder iDCs, indem Sie die lose anhaftenden Zellen am vierten Tag nach der Anpassung sanft vom Boden des Zellkulturkolbens abspülen.
Fügen Sie den Zellen einen Reifungscocktail hinzu, um reife dendritische Zellen oder mDCs zu erzeugen. Zwei Tage nach der Induktion der Reifung spülen Sie die mDCs vom Boden des Zellkulturkolbens ab. Wiederholen Sie die Spülung zweimal, und übertragen Sie dann die iDCs und mDCs auf 50 Milliliter-Röhren in ihrem jeweiligen Kulturmedium.
Ernten Sie die Zellen über Zentrifugation bei 300 mal g für fünf Minuten. Setzen Sie die Zellen vorsichtig in fünf bis 10 Milliliter RPMI 1640 pro Zellkulturkolben aus und kombinieren Sie die entsprechenden DC-Suspensionen in einem Rohr. Dann quantifizieren Sie die Zellen mit einer Zählkammer, um Temperaturänderungen beim Umgang mit den DCs zu vermeiden.
Übertragen Sie zwei Millionen iDCs oder mDCs in ein Zwei-Milliliter-Rohr, zentrifugieren Sie sie bei 3, 390 mal g für 1-1/2 Minuten und entsorgen Sie den Überstand. Sanft die Resuspend die Zellen in Infektion Medium. Hemmen Sie den autophagosomalen lysosomalen Abbauweg, indem Sie 10 mikromolare spautin-1 oder ein Mikromolar-Bafilomycin A1 dem Infektionsmedium eine Stunde vor der Infektion hinzufügen.
DMSO für die unbehandelte Steuerung hinzufügen und die Zellen auf einem Heizblock bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 300 RPM inkubieren. Für Infektionsstudien, impfen Sie die Zellen mit HSV-1 Virionen bei einer Vielzahl von Infektionen von zwei. Fügen Sie das entsprechende Volumen des MNT-Puffers als Mock-Steuerelement hinzu und inkubieren Sie die Zellen auf einem Heizblock bei 37 Grad Celsius für eine Stunde mit Schütteln.
Eine Stunde nach der Infektion, sammeln Sie die Zellen über Zentrifugation bei 3, 390 mal g für 1-1/2 Minuten, dann saugen Sie das Inokulum sanft und setzen Sie die Zellen in DC Medium. Saatgut-Mock behandelt und HSV-1 infizierte Zellen in einer Endkonzentration von einer Million Zellen pro Milliliter in eine Sechs-Brunnen-Platte. Nach einer Infektion nach 16 bis 24 Stunden iDCs mit einem Zellschaber oder mDCs durch Spülen ernten, die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Safe-Lock-Rohr übertragen und über Zentrifugation bei 3, 390 mal g für 1-1/2 Minuten sammeln.
Ernte und Zentrifugation mit den restlichen Zellen in den Brunnen wiederholen, dann das Pellet einmal mit einem Milliliter PBS waschen und die Zellen in Lysemischung kräftig wieder aufsetzen. Inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten und erhitzen Sie dann auf 95 Grad Celsius für 10 Minuten. Führen Sie SDS-Seiten- und Western-Blot-Analysen durch, um den Proteingehalt von LC3B1 und LC3B2, P62, ICP0 und ICP5 sowie GAPDH-Proteinen zu überprüfen.
Übertragen Sie am Tag 3,5 nach der Einhaltung 12 Millionen iDCs in ein 50-Milliliter-Rohr, zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 300 mal g und entsorgen Sie dann den Überstand. Führen Sie parallel eine zytometrische Flussanalyse durch, um den Reifestatus zu überwachen. Waschen Sie die iDCs in fünf Milliliter Opti-MEM ohne Phenolrot vorsichtig und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 300 mal g.
Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 200 Mikroliter opti-MEM wieder aus, wodurch die Zellkonzentration auf sechs Millionen Zellen pro 100 Mikroliter eingestellt wird. Fügen Sie 75 Picomole von FIP200-spezifischen oder rührigen siRNA zu vier Millimeter-Elektrocuvten hinzu und übertragen Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension in die jeweilige Küvette. Pulsieren Sie die iDCs direkt mit einem Elektroporationsgerät.
Nach der Elektroporation die iDCs in Sechs-Well-Platten mit frischem vorgewärmten DC-Medium übertragen, die Zellen in einer Endkonzentration von einer Million Zellen pro Milliliter säen und in den Inkubator legen. Nach 48 Stunden die Morphologie der elektroporated iDCs mikroskopisch untersuchen, dann die Zellen mit dem Zellschaber ernten und in 15 Milliliter-Röhren übertragen. Spülen Sie die Brunnen mit einem Milliliter PBS, ergänzt mit 0,1%EDTA, und übertragen Sie die Lösung auf die jeweiligen Rohre.
Dann spalten Sie die Zellen für jede siRNA-Bedingung, wie im Manuskript beschrieben. Verwenden Sie 500.000 Zellen, um den Reifezustand und die Zelllebensfähigkeit zu bewerten, verwenden Sie eine Million Zellen für die Western-Blot-Analyse, um die fiP200-spezifische Knockdown-Effizienz zu überprüfen, und verwenden Sie die verbleibenden Zellen für HSV-1-Infektionsexperimente. Die erzeugten iDCs und mDCs wurden phänotypisch durch Durchflusszytometrie analysiert, um eine Kontamination mit anderen Zelltypen auszuschließen und ihren Reifezustand zu überprüfen.
Die Zellen wurden mit CD3- und CD14-Antikörpern gefärbt, um eine Kontamination von T-Zellen bzw. Monozyten auszuschließen. Die Zellen wurden für CD11c gebeizt, die als hochgradig exprimierte allgemeine Marker für DCs dient. Zur Beurteilung des Reifestatus wurden CD80-, CCR7-, CD83- und MHCII-Antikörper verwendet, da diese Moleküle stark auf ausgereiften DCs exprimiert werden.
Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie wurden verwendet, um eine Infektion mit EGFP auszudrücken, die HSV-1 exzessiös ausdrückte. Starke GFP-Signale deuten auf eine nahezu vollständige Infektion von iDCs und mDCs hin. Western Blot Analyse wurde verwendet, um festzustellen, ob Spautin-1 oder Bafilomycin A1 autophagischen Fluss in HSV-1 infizierten Zellen hemmen.
In iDCs wird der autophagische Fluss durch den Rückgang der P62- und LC3B-Expression in Abwesenheit von Spautin-1 bzw. Bafilomycin A1 nachgewiesen. Im Gegensatz dazu hat die HSV-1-Infektion von mDCs ohne Spautin-1 keinen Einfluss auf die P62-Expression, während die Spautin-1- und BA1-Behandlung eine Anhäufung von LC3B-II induzierte, die die Induktion der Autophagie widerspiegelt, aber ein Versagen des autophagischen Umsatzes in mDCs. Die Reduzierung des FIP200-Proteinspiegels mit siRNA-Elektroporation führt auch zu einer starken Abnahme des autophagischen Flusses bei HSV-1-infizierten iDCs.
Dieses siRNA-basierte Elektroporationsprotokoll zur Hemmung der Autophagie hat keinen Einfluss auf die Zelllebensfähigkeit, den Bildphänotyp oder die Etablierung der HSV-1-Proteinexpression in iDCs. Unsere Elektroporationsprotokolle bieten die Möglichkeit, verschiedene DNA- oder RNA-Arten in Krankheiten und andere primäre Zelltypen zu liefern. Anschließend können eine Vielzahl von molekularen, funktionellen und Infektionsanalysen durchgeführt werden.
Die siRNA-basierte Strategie für Expression-Silencing bei Krankheiten ebnet den Weg, um die Funktion jedes Proteins von Interesse zu erforschen, auch kombiniert mit nachfolgenden funktionellen Assays.
