Наш протокол описывает методы эффективного вмешательства в ВПГ-1 индуцированной аутофагии оборота в дендритных клетках. И, в частности, мы сравниваем ингибитор на основе siRNA основе стратегии, чтобы блокировать аутофагию до заражения. В то время как ингибирующее вмешательство в аутофагию включает в себя потенциальные и специфические нецелетворные эффекты, наша разработанная стратегия на основе siRNA является более целевой.
Важно отметить, что оба представленных метода не влияют на стадии созревания заболевания. Демонстрация процедуры будет Петра Muhl-Зурбес, техник, и Александра Duthorn, аспирант, из моей лаборатории. Начните с сбора незрелых дендритных клеток или iDCs, мягко полоскания свободно приверженных клеток из нижней части колбы культуры клеток на четвертый день после присоединения.
Добавить созревания коктейль в клетки для создания зрелых дендритных клеток или MDCs. Через два дня после индукции созревания, промыть MDCs от нижней части колбы культуры клеток. Повторите полоскание дважды, а затем передать iDCs и MDCs на 50 миллилитров труб в их соответствующей среде культуры.
Урожай клеток с помощью центрифугации в 300 раз г в течение пяти минут. Аккуратно перерасходовать клетки в 5 до 10 миллилитров RPMI 1640 на колбу культуры клеток и объединить соответствующие подвески DC в одной трубке. Затем количественно клетки с помощью счетной камеры убедившись, чтобы избежать изменения температуры при обработке DCs.
Перенесите два миллиона iDCs или mDCs в двухмиллилитровую трубку, центрифуга их на 3, 390 раз g в течение 1-1/2 минут и отказаться от супернатанта. Аккуратно перерасходовать клетки в инфекционной среде. Запретить аутофагосомальный лизосомальный путь деградации, добавив 10 микромоляных спаутин-1 или один микромоляонный бафиломицин А1 к среде инфекции за час до заражения.
Добавьте DMSO для необработанного контроля и инкубировать клетки на нагревательном блоке при 37 градусах по Цельсию при тряске при 300 об/мин. Для исследования инфекции, привить клетки с ВПГ-1 виньоны при множественности инфекции двух. Добавьте соответствующий объем буфера MNT в качестве макета управления и инкубировать клетки на нагревательном блоке при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа с встряхивания.
Через час после заражения, собирать клетки с помощью центрифугации в 3, 390 раз г в течение 1-1/2 минут, а затем аспирировать инокулум мягко и повторного висякать клетки в среде постоянного тока. Семена макет лечение и HSV-1 инфицированных клеток в окончательной концентрации одного миллиона клеток на миллилитр в шесть хорошо пластины. В течение 16-24 часов после заражения, урожай iDCs с помощью клеточного скребка или MDCs путем полоскания, передать клетки в 1,5 миллилитров безопасной блокировки трубки и собирать их через центрифугации в 3, 390 раз г в течение 1-1/2 минут.
Повторите сбор урожая и центрифугирование с оставшимися клетками в колодцах, затем промойте гранулы один раз одним миллилитром PBS и энергично resuspend клетки в смеси лиза. Инкубировать образцы при температуре 37 градусов по Цельсию в течение 10 минут, а затем нагреть до 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Выполните анализ страницы SDS и западной помарки для проверки уровней белка LC3B1 и LC3B2, P62, ICP0 и ICP5, а также уровня белка GAPDH.
На 3,5-й день после присоединения, передать 12 миллионов iDCs в 50 миллилитров трубки, центрифуга их в 300 раз г в течение пяти минут, а затем отказаться от супернатанта. Параллельно проводится цитометрический анализ потока для мониторинга состояния созревания. Аккуратно вымойте iDCs в пяти миллилитров Opti-MEM без фенола красного и центрифуги их при 300 раз г в течение пяти минут.
Откажитесь от супернатанта и повторно посовелите клетки в 200 микролитров Opti-MEM, регулируя концентрацию клеток до шести миллионов клеток на 100 микролитров. Добавьте 75 пикомолов либо ФИП200 конкретных или вскарабкался siRNA на четыре миллиметра электрокуветов и передачи 100 микролитров клеточной подвески в соответствующие cuvette. Непосредственно пульсировать iDCs с помощью электропорации аппарата.
После электропорации перенесите iDCs в шести-хорошо пластины со свежей предварительно разогретой средой постоянного тока, посев клеток в окончательной концентрации одного миллиона клеток на миллилитр и поместите их в инкубатор. После 48 часов, изучить морфологию электропотерированных iDCs микроскопически, а затем собрать клетки с клеток скребок и передать их в 15 миллилитров труб. Промыть скважины одним миллилитровом PBS, дополненным 0,1%EDTA и перенести раствор в соответствующие трубки.
Затем разделите клетки для каждого состояния siRNA, как описано в рукописи. Используйте 500 000 клеток для оценки состояния созревания и жизнеспособности клеток, используйте один миллион клеток для анализа западных помарк для проверки эффективности конкретного нокдауна FIP200 и используйте оставшиеся клетки для экспериментов с инфекцией ВПГ-1. Генерируемые iDCs и mDCs были фенотипически проанализированы цитометрией потока для того чтобы исключить загрязнение с другими типами клетки и проверить их состояние созревания.
Клетки были окрашены антителами CD3 и CD14, чтобы исключить загрязнение Т-клеток и моноцитов соответственно. Клетки были окрашены для CD11c, который служит высоко выраженным общим маркером для DCs. Для оценки состояния созревания были использованы антитела CD80, CCR7, CD83 и MHCII, поскольку эти молекулы высоко выражены на зрелых ДК.
Флуоресцентная микроскопия и цитометрия потока были использованы для определения инфекции EGFP, выражающих ВПГ-1. Сильные сигналы GFP указывают на почти полную инфекцию iDCs и MDCs. Западный анализ помарки был использован для того чтобы обусловить если spautin-1 или bafilomycin A1 ингибируют аутофагический поток в инфицированных клетках HSV-1.
В iDCs, аутофагический поток демонстрируется снижением экспрессии P62 и LC3B при отсутствии спаутин-1 и бафиломицин А1 соответственно. В отличие от этого, ВПГ-1 инфекции MDCs при отсутствии спаутин-1 не влияет на экспрессию P62 в то время как spautin-1 и BA1 лечения индуцированных накопления LC3B-II, который отражает индукции аутофагии, но отказ аутофагии оборота в MDCs. Снижение уровня белка FIP200 с помощью электропорации siRNA также приводит к сильному снижению аутофагического потока в инфицированных ВПГ-1 МПЦ.
Этот протокол электропорации на основе siRNA для ингибирования аутофагии не влияет на жизнеспособность клеток, фенотип изображения или установление экспрессии белка ВПГ-1 в iDCs. Наши протоколы электропорации дают возможность доставлять различные виды ДНК или РНК в болезни и другие типы первичных клеток. Впоследствии можно проводить различные молекулярные, функциональные и инфекционные анализы.
Стратегия, основанная на siRNA для выражения замалчивания при болезни, прокладывает путь к изучению функции любого белка, представляющих интерес, также в сочетании с последующими функциональными анализами.
