يصف البروتوكول لدينا أساليب للتدخل بكفاءة مع HSV-1 الناتج التلقائي المستحث في الخلايا التشجر. وعلى وجه الخصوص، نحن نقارن مع مثبطات القائمة على استراتيجية مقرها وكالة RNA لمنع autophagy قبل العدوى. في حين أن التداخل القائم على مثبطات مع autophagy يشمل الآثار المحتملة والمحددة خارج الهدف، لدينا استراتيجية وضعت على أساس سيرنا هو أكثر استهداف محددة.
الأهم من ذلك ، لا تؤثر كل من التقنيات المقدمة على مراحل نضوج المرض. ومن خلال هذا الإجراء، ستكون بيترا مول زوربس، وهي فنيّة، وأليكساندرا دوثورن، طالبة خرّاج، من مختبري. تبدأ بحصاد الخلايا التشعب غير ناضجة أو iDCs عن طريق الشطف بلطف الخلايا المنضمة فضفاضة من الجزء السفلي من قارورة ثقافة الخلية في اليوم الرابع بعد الالتزام.
إضافة كوكتيل النضج إلى الخلايا لتوليد خلايا تيتشريدليك ناضجة أو mDCs. بعد يومين من تحريض النضج، شطف mDCs من الجزء السفلي من قارورة ثقافة الخلية. كرر الشطف مرتين، ثم نقل iDCs و mCS إلى أنابيب 50 ملليلتر في وسط ثقافتهم.
حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 300 مرة ز لمدة خمس دقائق. إعادة تعليق الخلايا بلطف في خمسة إلى 10 ملليلتر من 1640 في قارورة ثقافة الخلية في 1640 خلية والجمع بين تعليق DC المعنية في أنبوب واحد. ثم تحديد حجم الخلايا باستخدام غرفة العد مع التأكد من تجنب التغيرات في درجة الحرارة عند التعامل مع DCs.
نقل مليوني وحدة نفايات أو mDCs إلى أنبوب ملليلتر، والطرد المركزي لهم في 3،390 مرات ز لمدة 1-1/2 دقيقة والتخلص من كبرى. بلطف resuspend الخلايا في المتوسطة العدوى. تثبيط مسار التحلل الذاتي الليسسومية عن طريق إضافة 10 spautin ميكرومولار -1 أو واحد bafilomycin ميكرومولار A1 إلى متوسط العدوى ساعة واحدة قبل الإصابة.
إضافة DMSO للسيطرة غير المعالجة واحتضان الخلايا على كتلة التدفئة في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 300 دورة في الدقيقة. لدراسات العدوى، تلقيح الخلايا مع 1 HSV في 1 في تعدد العدوى من اثنين. إضافة حجم كل من MNT العازلة كتحكم وهمية واحتضان الخلايا على كتلة التدفئة في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز.
ساعة واحدة بعد العدوى، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 3، 390 مرات ز لمدة 1-1/2 دقيقة، ثم التعرق في الخلايا بلطف و resuspend في وسط العاصمة. البذور وهمية المعالجة وHSV-1 الخلايا المصابة في تركيز نهائي من مليون خلية في المليلتر في لوحة ستة جيدا. في 16 إلى 24 ساعة بعد العدوى، حصاد iDCs باستخدام مكشطة الخلية أو mDCs عن طريق الشطف، ونقل الخلايا إلى أنبوب قفل آمن 1.5 ملليلتر وجمعها عن طريق الطرد المركزي في 3، 390 مرات ز لمدة 1-1/2 دقيقة.
تكرار الحصاد والطرد المركزي مع الخلايا المتبقية في الآبار، ثم غسل بيليه مرة واحدة مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني وإعادة بقوة الخلايا في مزيج تحلل. احتضان العينات في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ثم الحرارة إلى 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بإجراء تحليل صفحة SDS ولطخة غربية للتحقق من مستويات البروتين LC3B1 و LC3B2 و P62 و ICP0 و ICP5 و GAPDH.
وفي اليوم 3.5 بعد الانضمام، قم بتحويل 12 مليون وحدة غم إلى أنبوب 50 ملليلتر، وأجهزة الطرد المركزي بمعدل 300 مرة ز لمدة خمس دقائق، ثم تخلص من المتطاير. بالتوازي، إجراء تحليل تدفق cytometric لرصد حالة النضج. غسل بلطف iDCs في خمسة ملليلتر من Opti-MEM دون الحمراء الفينول والطرد المركزي لهم في 300 مرة ز لمدة خمس دقائق.
تخلص من الخلايا المتراكبة و resuspend في 200 ميكرولترات من Opti-MEM تعديل تركيز الخلايا إلى ستة ملايين خلية لكل 100 ميكرولترات. إضافة 75 picomoles إما FIP200 محددة أو تدافعت سيرنا إلى أربعة ملليمتر electrocuvettes ونقل 100 ميكرولترات من تعليق الخلية في cuvette المعنية. نبض مباشرة iDCs باستخدام جهاز كهربائي.
بعد الكهربة، نقل iDC إلى لوحات ستة جيدا مع الطازجة قبل الدافئة DC المتوسطة، بذر الخلايا بتركيز نهائي من مليون خلية لكل ملليلتر ووضعها في الحاضنة. بعد 48 ساعة ، فحص مورفولوجيا iDCs الكهروبيرة مجهريا ، ثم حصاد الخلايا مع مكشطة الخلية ونقلها إلى أنابيب 15 ملليلتر. شطف الآبار مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني تكملها 0.1٪EDTA ونقل الحل إلى الأنابيب المعنية.
ثم تقسيم الخلايا لكل حالة من حالات الرنا كما هو موضح في المخطوطة. استخدام 500، 000 خلية لتقييم حالة النضج والبقاء الخلية، واستخدام مليون خلية لتحليل البقع الغربية للتحقق من كفاءة ضربة قاضية محددة FIP200 واستخدام الخلايا المتبقية لتجارب العدوى HSV-1. تم تحليل iDCs المنشأة و mDCs بشكل ظاهري بواسطة قياس التدفق من أجل استبعاد التلوث بأنواع الخلايا الأخرى والتحقق من حالة نضوجها.
كانت الخلايا ملطخة باجسام مضادة CD3 وD14 لاستبعاد T-cell و monocyte التلوث على التوالي. كانت الخلايا ملطخة لـ CD11c الذي يعمل كعلامة عامة معبّر عنها بشدة للبلدان النامية. لتقييم حالة النضج، تم استخدام أجسام مضادة CD80 وCR7 وD83 و MHCII لأن هذه الجزيئات يتم التعبير عنها بشدة في DCs الناضجة.
تم استخدام المجهر الفلوري والتدفق الاستئصالية لتحديد العدوى مع EGFP التعبير عن HSV-1. وتشير إشارات GFP القوية إلى عدوى شبه كاملة للبلدان النامية الجزرية المُنَوِّدَة والبلدان النامية الجزرية المُمَرَكِّلة. تم استخدام تحليل البقعة الغربية لتحديد ما إذا كان spautin-1 أو bafilomycin A1 تمنع تدفق الأوتوفاجيك في الخلايا المصابة HSV-1.
في iDCs، يظهر التدفق الأوتوفائي من خلال انخفاض التعبير P62 و LC3B في غياب spautin-1 و bafilomycin A1 على التوالي. في المقابل، لا تؤثر عدوى HSV-1 من mCS في غياب spautin-1 على تعبير P62 بينما تسبب علاج spautin-1 وBA1 في تراكم LC3B-II الذي يعكس تحريض autophagy ولكن فشل دوران autophagic في mDCs. خفض مستويات البروتين FIP200 مع كهرباء سيرنا يسبب أيضا انخفاضا قويا في تدفق الأوتوفاجيك في HSV-1 iDCs المصابة.
لا يؤثر بروتوكول الإلكتروبور القائم على الـ siRNA لمنع الخلايا أو النمط الظاهري للصورة أو إنشاء تعبير بروتين HSV-1 في iDCs. توفر بروتوكولات الكهربة لدينا الفرصة لتقديم أنواع الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي المتميزة إلى الأمراض وأنواع الخلايا الأولية الأخرى. في وقت لاحق، يمكن إجراء مجموعة متنوعة من التحليلات الجزيئية والوظيفية والعدوى.
استراتيجية مقرها siRNA للتعبير عن إسكات في المرض يمهد الطريق لاستكشاف وظيفة أي بروتين من الفائدة، جنبا إلى جنب أيضا مع المقايسات الوظيفية اللاحقة.
