Nosso protocolo descreve métodos para interferir eficientemente com a rotatividade autofágica induzida pelo HSV-1 em células dendríticas. E, em particular, comparamos um inibidor baseado em uma estratégia baseada em siRNA para bloquear a autofagia antes da infecção. Embora a interferência baseada em inibidores com a autofagia inclua efeitos potenciais e específicos fora do alvo, nossa estratégia desenvolvida baseada em siRNA é mais específica para o alvo.
É importante ressaltar que ambas as técnicas apresentadas não afetam os estágios de maturação da doença. Demonstrando o procedimento estarão Petra Muhl-Zurbes, uma técnica, e Alexandra Duthorn, uma estudante de pós-graduação, do meu laboratório. Comece colhendo células dendríticas imaturas ou iDCs enxaguando suavemente as células frouxamente aderentes do fundo do frasco de cultura celular no quarto dia após a adesão.
Adicione coquetel de maturação às células para gerar células dendríticas maduras ou mDCs. Dois dias após a indução da maturação, enxágue os mDCs do fundo do frasco de cultura celular. Repita a lavagem duas vezes e transfira os iDCs e os mDCs para tubos de 50 mililitros em seu respectivo meio de cultura.
Colher as células através da centrifugação a 300 vezes g durante cinco minutos. Resuspenque suavemente as células em cinco a dez mililitros de RPMI 1640 por frasco de cultura celular e combine as respectivas suspensões DC em um tubo. Em seguida, quantifique as células usando uma câmara de contagem certificando-se de evitar alterações de temperatura ao manusear os DCs.
Transfira dois milhões de iDCs ou mDCs em um tubo de dois mililitros, centrifuá-los a 3.390 vezes g por 1-1/2 minutos e descartar o supernasce. Suavemente, o resususpende as células em meio de infecção. Iniba a via de degradação lyosômica autofargosomal adicionando 10 micromolar spautin-1 ou um micromolar bafilomicina A1 ao meio da infecção uma hora antes da infecção.
Adicione DMSO para o controle não tratado e incubar as células em um bloco de aquecimento a 37 graus Celsius com agitação a 300 RPM. Para estudos de infecção, inocular as células com virions de HSV-1 em uma multiplicidade de infecção de dois. Adicione o respectivo volume de tampão MNT como um controle simulado e incubar as células em um bloco de aquecimento a 37 graus Celsius durante uma hora com agitação.
Uma hora após a infecção, recolham as células através da centrifugação a 3.390 vezes g durante 1-1/2 minutos, depois aspirem o inóculo suavemente e resuspenquem as células no meio DC. Sementes simuladas tratadas e células infectadas por HSV-1 em uma concentração final de um milhão de células por mililitro em uma placa de seis poços. Às 16 a 24 horas após a infecção, colhe iDCs usando um raspador de células ou mDCs enxaguando, transfira as células para um tubo de bloqueio seguro de 1,5 mililitro e colete-as através de centrifugação a 3.390 vezes g por 1-1/2 minutos.
Repita a colheita e a centrifugação com as demais células dos poços, depois lave a pelota uma vez com um mililitro de PBS e resuspenja vigorosamente as células na mistura de lise. Incubar as amostras a 37 graus Celsius por 10 minutos e depois aquecer a 95 graus Celsius por 10 minutos. Realize a análise de página SDS e manchas ocidentais para verificar os níveis de proteína LC3B1 e LC3B2, P62, ICP0 e ICP5 e GAPDH.
No dia 3,5 pós-adesão, transfira 12 milhões de iDCs para um tubo de 50 mililitros, centrifuse-os a 300 vezes g por cinco minutos e, em seguida, descarte o supernante. Paralelamente, realize a análise citométrica de fluxo para monitorar o estado de maturação. Lave suavemente os iDCs em cinco mililitros de Opti-MEM sem fenol vermelho e centrifuá-los a 300 vezes g por cinco minutos.
Descarte o supernascer e resuspenja as células em 200 microliters do Opti-MEM ajustando a concentração celular para seis milhões de células por 100 microlitrais. Adicione 75 picomoles de siRNA específico ou mexido fip200 a eletrocuvetas de quatro milímetros e transfira 100 microliters da suspensão celular para o respectivo cuvette. Pulso direto dos iDCs usando um aparelho de eletroporação.
Após a eletroporação, transfira os iDCs em placas de seis poços com meio DC pré-aquecido fresco, semeando as células em uma concentração final de um milhão de células por mililitro e coloque-as na incubadora. Após 48 horas, examine a morfologia dos iDCs eletroporados microscopicamente, depois colde as células com o raspador de células e transfira-as em tubos de 15 mililitros. Enxágüe os poços com um mililitro de PBS suplementado com 0,1%EDTA e transfira a solução para os respectivos tubos.
Em seguida, dividiu as células para cada condição de siRNA, conforme descrito no manuscrito. Use 500.000 células para avaliar o estado de maturação e a viabilidade celular, use um milhão de células para análise de manchas ocidentais para verificar a eficiência específica do knockdown fip200 e use as células restantes para experimentos de infecção por HSV-1. Os iDCs gerados e os MDCs foram analisados fenotipicamente por citometria de fluxo, a fim de excluir a contaminação com outros tipos de células e verificar seu estado de maturação.
As células foram manchadas com anticorpos CD3 e CD14 para excluir a contaminação de células T e monócitos, respectivamente. As células foram manchadas para CD11c, que serve como um marcador geral altamente expresso para DCs. Para avaliar o estado de maturação, foram utilizados anticorpos CD80, CCR7, CD83 e MHCII porque essas moléculas são altamente expressas em DCs maduros.
A microscopia de fluorescência e a citometria de fluxo foram utilizadas para determinar a infecção com eGFP expressando HSV-1. Sinais fortes de GFP indicam infecção quase completa de iDCs e mDCs. A análise da mancha ocidental foi usada para determinar se a spautin-1 ou a bafilomicina A1 inibem o fluxo autofágico em células infectadas pelo HSV-1.
Nos iDCs, o fluxo autofágico é demonstrado pelo declínio da expressão P62 e LC3B na ausência de spautin-1 e bafilomicina A1, respectivamente. Em contraste, a infecção por HSV-1 de MDCs na ausência de spautin-1 não afeta a expressão P62 enquanto o tratamento de spautin-1 e BA1 induziu um acúmulo de LC3B-II que reflete a indução da autofagia, mas uma falha de rotatividade autofárgica em mDCs. A redução dos níveis de proteína FIP200 com eletroporação de siRNA também causa uma forte diminuição no fluxo autofágico em iDCs infectados pelo HSV-1.
Este protocolo de eletroporação baseado em siRNA para inibição da autofagia não afeta a viabilidade celular, o fenótipo de imagem ou o estabelecimento da expressão proteica HSV-1 em iDCs. Nossos protocolos de eletroporação oferecem a oportunidade de fornecer espécies distintas de DNA ou RNA em doenças e outros tipos de células primárias. Posteriormente, uma variedade de análises moleculares, funcionais e de infecção podem ser realizadas.
A estratégia baseada em siRNA para silenciar a expressão em doenças abre caminho para explorar a função de qualquer proteína de interesse, também combinada com ensaios funcionais subsequentes.
