该协议提供了一种新方法，用于量化树突状的分支动力学，并使用实时时间推移成像和3D图像注释软件开发神经元。该技术对分支终端进行图像和跟踪，为测量树突颤变性飞多维的动态行为提供了一种快速、高效的方法。使用此方法的研究有助于深入了解发育和活动如何调节树突形态生成。
我们的方法适用于体外和体内设置中贴稀疏标记的神经元。执行此过程时，请记住，必须仔细调整成像参数，以实现足够的时间和空间分辨率。为了从幼虫中采集大脑，在解剖显微镜下使用一对五号标准尖端解剖钳将幼虫标本放在位上，同时使用另一对来仔细解剖大脑，保存眼盘、脑叶和腹神经线。
然后取出附着的肌肉，以尽量减少样品在成像过程中的任何运动。当所有大脑都收获后，使用真空润滑脂将一个方形腔室绘制到玻璃滑梯上，并在腔室中加入 20 微升外部盐水溶液。使用钳子将大脑转移到腔室，并在显微镜下调整大脑的位置，将后侧朝上。
用玻璃盖滑盖住室，轻轻按压盖滑，以减少成像过程中样品漂移。要识别含有单独标记神经元的大脑外植，在解剖后 30 分钟内选择 40 倍水浸目标以及荧光光源。选择两个光子激光调谐到 920 纳米和非 Dscan 探测器，并设置成像参数，以每帧 512 x 512 像素和每 Z 堆栈 1 分钟收集图像 10 分钟。
然后，调整光学和数字变焦，以实现足够的 X、Y、Z 分辨率，同时确保整个树突轴在一分钟内覆盖。这些设置将生成典型 X、Y、Z 分辨率为 0.11 x 0.11 x 0.25 微米的图像。对于漂移校正，请打开合适的漂移校正软件程序中感兴趣的文件，然后单击"编辑和编辑微观参数"。
如果有两个光子选项，并遵循软件定义的工作流，则将显微镜类型设置为两个光子图像的"宽场"。对于去卷积，在去卷积软件中打开漂移校正图像，然后按照工作流操作。然后，将解构图像保存在文件类型中，该文件类型由能够分析 4D 数据和报告图像中已定义点的空间坐标的后续图像注释软件支持的文件类型中。
对于图像注解，在图像注释软件中打开解构图像，并在 3D 的所有时间点检查和标记分支提示。图像注释软件将报告和存储标记分支提示的空间和时间坐标。将坐标信息导出为 CSV 文件，以便进行后续计算。
在"斑点"模块中，单击"跳过自动创建"，手动编辑，然后选中"自动连接所选点"复选框。查看时间序列中的帧，然后选择用于注释的分支。按住 Shift 键，单击分支终端提示以添加点。
然后，单击"统计"选项卡，选择"详细值"、"特定值"和"位置"。将显示记录的空间和时间坐标信息。单击"保存"以将数据导出为 CSV 文件。
要计算 3D 中的分支提示位置，请打开 CSV 文件作为电子表格并选择"轨道 ID"列。单击"将最小排序为"最大"并接受展开"选择"。排序后，轨道 ID 将标识每个唯一的树突分支，并且来自同一分支的点共享相同的跟踪 ID。
在电子表格中，添加"距离"列，并使用坐标计算每两个时间相邻点的距离。要测量单个体素级别的轻微运动，请重置小于 0.3 微米的所有距离值，以筛选任何未校正的漂移或不完美的图像注释。接下来，创建"置换"列，将值从"距离"列复制到"置换"列。
手动为每个分支尖端分配扩展和缩回事件。如果是扩展，则保持正位移值不变。如果是缩回，则将相应的置换值更改为负值。
然后，在新的 Event 列中，求和单个扩展和缩回事件的置换值。在这段视频中，可以观察到从具有代表性的单独标记的腹腹神经元收集的最大强度投影图像系列。单帧图像允许评估缩回和扩展事件。
分支终端的半自动 4D 跟踪允许注释单独标记的腹体横向神经元的动态分支端子，如所证明的。计算每个时间点分支运动的方向和距离，可以比较不同发育阶段的单独标记的腹向神经元的树突分支动力学。最重要的步骤是在解剖和安装期间保持脑组织和树突形态的完整性。
原始图像系列质量对于成功的跟踪和定量也至关重要。利用这项技术，我们获得了在开发果蝇中心神经元时对树突纤维素进行定量分析的能力，并探索与树突成熟和突触相关的分子机制。
