يوفر هذا البروتوكول نهجًا جديدًا لتحديد ديناميات الفرع في arbor المتسخ وتطوير الخلايا العصبية باستخدام التصوير المباشر لفاصل الوقت وبرنامج شرح صورة ثلاثية الأبعاد. هذه التقنية صور وتتبع المحطات الفرعية توفير طريقة سريعة وفعالة لقياس السلوكيات الديناميكية من الفيلوبوديا التشجر. توفر الأبحاث التي تستخدم هذه الطريقة نظرة ثاقبة على فهم كيفية تنظيم التطوير والنشاط لتحول التشعب.
طرقنا قابلة للتطبيق على الخلايا العصبية المسماة قليلة في كل من في المختبر وفي إعدادات الجسم الحي. عند تنفيذ هذا الإجراء، تذكر أنه يجب تعديل معلمات التصوير بعناية لتحقيق دقة زمنية ومكانية كافية. لحصاد العقول من drosophila اليرقات، تحت مجهر تشريح استخدام زوج واحد من عدد خمسة أصابع تشريح تلميح القياسية لعقد عينة اليرقات في مكان أثناء استخدام الآخر لتشريح بعناية الدماغ، والحفاظ على أقراص العين، فصوص الدماغ، والحبل العصبي البطني.
ثم قم بإزالة العضلات المرفقة لتقليل أي حركة للعينة أثناء التصوير. عندما تم حصاد كل من العقول، واستخدام الشحوم فراغ لرسم غرفة مربعة على شريحة زجاجية وإضافة 20 ميكرولترات من محلول ملحي خارجي إلى الغرفة. استخدام ملقط لنقل العقول إلى الغرفة وضبط مواقف من العقول تحت المجهر مع الجانبين الظهرية التي تواجه.
غطي الغرفة بزلة غلاف زجاجي واضغط بلطف على زلة الغطاء لتقليل الانجراف للعينة أثناء إجراء التصوير. لتحديد explants الدماغ التي تحتوي على الخلايا العصبية المسمى بشكل فردي، في غضون 30 دقيقة من تشريح حدد هدف غمر الماء 40X ومصدر ضوء epifluorescence. حدد ليزر فوتون ضبطها إلى 920 نانومتر وجهاز الكشف غير Dscan وتعيين المعلمات التصوير لجمع الصور في 512 في 512 بكسل لكل إطار ودقيقة واحدة لكل Z كومة لمدة 10 دقائق.
ثم، ضبط التكبير البصري والرقمي لتحقيق ما يكفي X، Y، Z القرار مع ضمان تغطية كامل arbor dendritic في غضون دقيقة واحدة. وسوف تولد الإعدادات الصور مع نموذجي X، ص، Z القرار من 0.11 في 0.11 في 0.25 ميكرومتر. لتصحيح الانجراف، افتح الملف الذي يهمك في برنامج تصحيح انجراف مناسب وانقر على تحرير وتحرير المعلمات المجهرية.
تعيين نوع المجهر إلى حقل واسع لصورتين الفوتون إذا كان هناك خيار فوتون اثنين واتبع سير العمل المعرفة من قبل البرنامج. لdethonvolution، فتح الصورة المصححة الانجراف في برنامج فك التشفير واتبع سير العمل. ثم احفظ الصورة deconvolved في نوع ملف معتمد من قبل برنامج التعليق التوضيحي الصورة اللاحقة قادرة على تحليل البيانات 4D والإبلاغ عن الإحداثيات المكانية من البقع المعرفة داخل الصورة.
للتعليق التوضيحي للصورة، افتح الصورة deconvolved في برنامج التعليق التوضيحي للصورة وتفحص وعلامة نصائح الفرع في جميع النقاط الزمنية في 3D. سيقوم برنامج التعليق التوضيحي للصورة بالإبلاغ عن الإحداثيات المكانية والزمانية لنصائح الفرع المميزة وتخزينها. تصدير معلومات الإحداثيات كملف CSV من أجل الحسابات اللاحقة.
في الوحدة النمطية البقع، انقر فوق تخطي إنشاء تلقائي، تحرير يدوياً، ثم تحقق من خانة الاختيار التوصيل التلقائي إلى بقعة محددة. راجع الإطارات في السلسلة الزمنية وحدد فرع للتعليق التوضيحي. اضغط على مفتاح Shift، انقر فوق طرف الطرف الطرفي الفرعي لإضافة بقعة.
ثم انقر فوق علامة التبويب إحصائيات، حدد مفصلة، وقيم محددة، والموضع. سيتم عرض معلومات الإحداثيات المكانية والزمانية المسجلة. انقر فوق حفظ لتصدير البيانات كملف CSV.
لحساب موضع طرف الفرع في 3D، افتح ملف CSV كجداول بيانات وحدد عمود "معرف المسار". انقر فوق فرز أصغر إلى أكبر وقبول توسيع التحديد. بعد الفرز، معرف المسار سوف تحدد كل فرع dendritic فريدة من نوعها والبقع من نفس الفرع حصة نفس المسار ID.The الوقت العمود سيتم تخزين المعلومات من أطر زمنية مختلفة.
في جدول البيانات، أضف عمود المسافة، واستخدم الإحداثيات لحساب المسافة لكل نقطتين متجاورتين زمنيًا. لقياس الحركات الطفيفة عند مستوى voxel واحد، قم بإعادة تعيين كل قيم المسافة التي تقل عن 0.3 ميكرومتر لتصفية أي تعليق توضيحي غير مصحح للصورة أو غير كامل. بعد ذلك، قم بإنشاء عمود إزاحة ثم نسخ القيم من عمود المسافة إلى العمود الإزاحة.
تعيين أحداث التمديد والسحب يدويًا لكل طرف فرع. إذا كان امتداداً، اترك قيمة النزوح الإيجابية دون تغيير. إذا كان التراجع، تغيير قيمة إزاحة المقابلة إلى قيمة سالبة.
ثم، في عمود حدث جديد، جمع قيم الإزاحة لأحداث التمديد والسحب الفردية. في هذا الفيديو، يمكن ملاحظة سلسلة صور متوقعة بالحد الأقصى للكثافة تم جمعها من خلية عصبية جانبية مُنَتَسمة بشكل فردي. تسمح صور الإطار الواحد بتقييم أحداث التراجع والامتداد.
يسمح التتبع رباعي الأبعاد شبه المميّس لمحطات الفروع بالشرح التوضيحي لمحطات الفروع الديناميكية للخلايا العصبية الجانبية البطنية المسماة بشكل فردي كما هو موضح. حساب اتجاه ومسافة حركات الفرع في كل نقطة زمنية يسمح مقارنة ديناميات فرع التشعب لالخلايا العصبية الجانبية البطيني المسمى بشكل فردي في مراحل مختلفة من النمو. الخطوة الأكثر أهمية هي الحفاظ على سلامة أنسجة المخ وdendrite مورفيلوري أثناء تشريح وتركيب.
جودة سلسلة الصور الخام هي أيضا حاسمة لنجاح التتبع وتحديد الكم. باستخدام هذه التقنية اكتسبنا القدرة على إجراء تحليل كمي للdendrite filopodia في تطوير الخلايا العصبية المركزية drosophila واستكشاف الآلات الجزيئية المتعلقة النضج dendrite وsasaptogenesis.
