Bu protokol, dendritik arbor'un dal dinamiklerini ölçmek ve canlı zaman atlamalı görüntüleme ve 3D görüntü ek açıklama yazılımı kullanarak nöronlar geliştirmek için yeni bir yaklaşım sağlar. Bu teknik, dendritik filopodia'nın dinamik davranışlarını ölçmek için hızlı ve verimli bir yöntem sağlayan dal terminallerini görüntüler ve izler. Bu yöntemi kullanarak yapılan araştırmalar, gelişim ve aktivitenin dendrite morfogenezi nasıl düzenlediğini anlamayı sağlar.
Yöntemlerimiz hem in vitro hem de in vivo ortamlarda seyrek etiketli nöronlar için geçerlidir. Bu yordamı gerçekleştirirken, yeterli zamansal ve uzamsal çözünürlüğe ulaşmak için görüntüleme parametrelerinin dikkatle ayarlanması gerektiğini unutmayın. Larva drosophila beyin hasat için, bir diseksiyon mikroskop altında bir çift beş standart uç diseksiyon forceps yerinde bir larva örneği tutmak için diğer kullanırken dikkatle beyin dışarı incelemek için, göz diskleri, beyin lobları ve ventral sinir kordonu koruyarak.
Daha sonra görüntüleme sırasında numunenin herhangi bir hareketini en aza indirmek için bağlı kasları çıkarın. Tüm beyinler hasat edildiğinde, bir cam slayt üzerine bir kare oda çizmek ve hazneye 20 mikrolitre harici tuzlu çözelti eklemek için vakum yağı kullanın. Beyinleri odaya aktarmak ve sırt kenarları yukarı bakacak şekilde mikroskop altındaki beyinlerin pozisyonlarını ayarlamak için çersepsi kullanın.
Bir cam kapak fişi ile oda kapağı ve görüntüleme işlemi sırasında örnek sürüklenen azaltmak için kapak fişi hafifçe basın. Ayrı ayrı etiketlenmiş nöronlar içeren beyin ekstrelerini tanımlamak için, diseksiyondan sonraki 30 dakika içinde 40X su daldırma hedefi ve epifloresan ışık kaynağı seçin. 920 nanometre ve Dscan olmayan bir dedektöre ayarlanmış iki foton lazer seçin ve görüntüleme parametrelerini 512'de kare başına 512 piksel ve 10 dakika boyunca Z-stack başına bir dakika olarak toplamak için ayarlayın.
Daha sonra, bir dakika içinde tüm dendritik arbor kapsama sağlarken yeterli X, Y, Z çözünürlüğü elde etmek için optik ve dijital zum ayarlayın. Ayarlar, 0,11 x 0,11 x 0,25 mikrometre ile tipik bir X, Y, Z çözünürlüğüne sahip görüntüler oluşturur. Drift düzeltme için, uygun bir drift düzeltme yazılımı programında ilgi dosyasını açın ve Mikroskobik Parametreleri Edit ve Edit'i tıklatın.
İki foton seçeneği varsa, iki foton görüntüsü için mikroskop türünü Geniş Alan olarak ayarlayın ve yazılım tarafından tanımlanan iş akışını izleyin. Deconvolution için, deconvolution yazılımında sürüklenen görüntüyü açın ve iş akışını izleyin. Ardından, 4B verileri çözümleme ve görüntü içindeki tanımlı noktaların uzamsal koordinatlarını raporlama yeteneğine sahip sonraki görüntü ek açıklama yazılımı tarafından desteklenen bir dosya türünde deconvolved görüntü kaydedin.
Görüntü ek açıklama için, görüntü ek açıklama yazılımında deconvolved görüntü açın ve incelemek ve 3D her zaman noktalarında şube ipuçlarını işaretleyin. Görüntü ek açıklama yazılımı, işaretli dal ipuçlarının uzamsal ve zamansal koordinatlarını bildirir ve saklar. Sonraki hesaplamalar için koordinat bilgilerini CSV dosyası olarak dışa aktarın.
Noktalar modülünde Otomatik Oluşturmayı Atla'yı tıklatın, El ile Edin'i tıklatın ve Otomatik Bağlantı'yı Seçili Nokta onay kutusuna işaretleyin. Zaman serisindeki kareleri gözden geçirin ve ek açıklama için bir dal seçin. Shift tuşunu basılı tutarak, nokta eklemek için şube terminal ucunu tıklatın.
Ardından, İstatistikler sekmesini tıklatın, Ayrıntılı, Belirli Değerler ve Konum'u seçin. Kaydedilen mekansal ve zamansal koordinat bilgileri görüntülenir. Verileri CSV dosyası olarak aktarmak için Kaydet'i tıklatın.
Şube ipucu yerleşimini 3B olarak hesaplamak için CSV dosyasını elektronik tablo olarak açın ve İzID sütununa seçin. En Küçükten En Büyüye Sırala'yı tıklatın ve Seçimi Genişlet'i kabul edin. Sıralamadan sonra, Track ID her benzersiz dendritik dalı tanımlar ve aynı daldaki noktalar aynı Track ID.The Time sütunundaki noktaları paylaşır ve farklı zaman dilimlerindeki bilgileri saklar.
Elektronik tabloda, bir Mesafe sütunu ekleyin ve her iki zamansal bitişik noktanın uzaklıklarını hesaplamak için koordinatları kullanın. Tek voxel düzeyindeki küçük hareketleri ölçmek için, düzeltilmemiş sürüklenen veya kusurlu görüntü ek açıklamalarını filtrelemek için 0,3 mikrometreden küçük tüm mesafe değerlerini sıfırlayın. Ardından, Bir Yer Değiştirme sütunu oluşturun ve uzaklık sütunundaki değerleri Yer değiştirme sütununa kopyalayın.
Her şube ucu için uzantı ve geri çekme olaylarını el ile atayın. Bu bir uzantıysa, pozitif yer değiştirme değerini değiştirmeden bırakın. Bu bir geri çekme ise, karşılık gelen yer değiştirme değerini negatif değere değiştirin.
Ardından, yeni bir Olay sütununda, tek tek uzantı ve geri çekme olayları için yer değiştirme değerlerini toplayın. Bu videoda, ventral lateral nöron etiketli bir temsilciden toplanan maksimum yoğunluklu yansıtılan görüntü serileri gözlemlenebilir. Tek kare görüntüler, geri çekme ve uzatma olaylarının değerlendirilmesini sağlar.
Şube terminallerinin yarı otomatik 4D takibi, tek tek etiketlenmiş ventral lateral nöronların dinamik dal terminallerinin gösterildiği gibi ek açıklamayapılmasına olanak sağlar. Her zaman noktasında dal hareketlerinin yönü ve uzaklığı hesaplanması, farklı gelişim selevrelerinde ayrı ayrı etiketlenmiş ventral lateral nöronlar için dendritik dal dinamiğinin karşılaştırılmasına olanak sağlar. En önemli adım diseksiyon ve montaj sırasında beyin dokusu ve dendrit morfolojisinin bütünlüğünü korumaktır.
Ham görüntü serisi kalitesi de başarılı izleme ve nicelik lendirme için önemlidir. Bu tekniği kullanarak drosophila santral nöronların geliştirilmesinde dendrit filopodia'nın kantitatif analizini yapma ve dendrit maturasyonu ve sinaptogenez ile ilgili moleküler makineleri keşfetme becerisi kazandık.
