Este protocolo proporciona un nuevo enfoque para cuantificar la dinámica de las ramas del árbol dendrítico y desarrollar neuronas utilizando imágenes de lapso de tiempo en vivo y un software de anotación de imágenes 3D. Esta técnica realiza imágenes y seguimientos de los terminales de bifurcación proporcionando un método rápido y eficiente para medir los comportamientos dinámicos de la filopodia dendrítica. La investigación con este método proporciona información sobre cómo el desarrollo y la actividad regulan la morfogénesis de dendrita.
Nuestros métodos son aplicables a las neuronas escasamente etiquetadas en entornos in vitro e in vivo. Al realizar este procedimiento, recuerde que los parámetros de imagen deben ajustarse cuidadosamente para lograr una resolución temporal y espacial suficiente. Para cosechar cerebros de escoria larvaria, bajo un microscopio diseccionado utilice un par de fórceps de disección de punta estándar número cinco para mantener un espécimen larval en su lugar mientras usa el otro para diseccionar cuidadosamente el cerebro, preservando los discos oculares, los lóbulos cerebrales y el cordón nervioso ventral.
A continuación, retire los músculos conectados para minimizar cualquier movimiento de la muestra durante la toma de imágenes. Cuando todos los cerebros hayan sido cosechados, utilice grasa al vacío para dibujar una cámara cuadrada en un portaobjetos de vidrio y agregue 20 microlitros de solución salina externa a la cámara. Utilice los fórceps para transferir los cerebros a la cámara y ajustar las posiciones de los cerebros bajo el microscopio con los lados dorsales hacia arriba.
Cubra la cámara con un resbalón de cubierta de vidrio y presione suavemente en el resbalón de la cubierta para reducir la deriva de la muestra durante el procedimiento de diagnóstico por imágenes. Para identificar las plantas cerebrales que contienen neuronas etiquetadas individualmente, dentro de los 30 minutos de la disección seleccione un objetivo de inmersión en agua 40X y una fuente de luz de epifluorescencia. Seleccione un láser de dos fotones ajustado a 920 nanómetros y un detector que no sea Dscan y configure los parámetros de imagen para recopilar las imágenes a 512 por 512 píxeles por fotograma y un minuto por pila Z durante 10 minutos.
A continuación, ajuste el zoom óptico y digital para lograr una resolución X, Y, Z suficiente mientras garantiza la cobertura de todo el árbol dendrítico en un minuto. Los ajustes generarán imágenes con una resolución típica X, Y, Z de 0,11 por 0,11 por 0,25 micrómetros. Para la corrección de deriva, abra el archivo de interés en un programa de software de corrección de deriva adecuado y haga clic en Editar y editar parámetros microscópicos.
Establezca el tipo de microscopio en Campo ancho para las dos imágenes de fotones si hay una opción de dos fotones y siga el flujo de trabajo definido por el software. Para la desconvolución, abra la imagen corregida de deriva en el software de desconvolución y siga el flujo de trabajo. A continuación, guarde la imagen desconvolucionada en un tipo de archivo compatible con el software de anotación de imágenes posterior capaz de analizar datos 4D e informar de las coordenadas espaciales de los puntos definidos dentro de la imagen.
Para la anotación de imagen, abra la imagen desconvolucionada en el software de anotación de imágenes y examine y marque las sugerencias de bifurcación en todos los puntos de tiempo en 3D. El software de anotación de imágenes informará y almacenará las coordenadas espaciales y temporales de las puntas de bifurcación marcadas. Exporte la información de coordenadas como un archivo CSV para cálculos posteriores.
En el módulo Puntos, haga clic en Omitir creación automática, Editar manualmente y active la casilla de verificación Conexión automática a spot seleccionado. Revise los fotogramas de la serie temporal y seleccione una rama para la anotación. Manteniendo pulsada la tecla Mayús, haga clic en la punta del terminal de bifurcación para agregar un punto.
A continuación, haga clic en la pestaña Estadísticas, seleccione Detallado, Valores específicos y Posición. Se mostrará la información de coordenadas espaciales y temporales registradas. Haga clic en Guardar para exportar los datos como un archivo CSV.
Para calcular la ubicación de la punta de bifurcación en 3D, abra el archivo CSV como una hoja de cálculo y seleccione la columna ID de pista. Haga clic en Ordenar de menor a mayor y acepte Expandir la selección. Después de ordenar, Track ID identificará cada rama dendrítica única y los puntos de la misma rama comparten el mismo ID de pista.La columna De tiempo almacenará la información de diferentes marcos de tiempo.
En la hoja de cálculo, agregue una columna Distancia y utilice las coordenadas para calcular la distancia de cada dos puntos adyacentes temporalmente. Para medir movimientos menores en el nivel de un solo voxel, restablezca todos los valores de distancia inferiores a 0,3 micrómetros para filtrar cualquier desviación no corregida o anotación de imagen imperfecta. A continuación, cree una columna Desplazamiento y copie los valores de la columna Distancia a la columna Desplazamiento.
Asigne manualmente los eventos de extensión y retracción para cada punta de bifurcación. Si se trata de una extensión, deje el valor de desplazamiento positivo sin cambios. Si es una retracción, cambie el valor de desplazamiento correspondiente a un valor negativo.
A continuación, en una nueva columna Evento, sume los valores de desplazamiento para los eventos de extensión y retracción individuales. En este video, se puede observar una serie de imágenes proyectadas de máxima intensidad recopilada de una neurona lateral ventral etiquetada individualmente representativa. Las imágenes de fotograma único permiten evaluar los eventos de retracción y extensión.
El seguimiento 4D semiautomatado de los terminales de rama permite la anotación de los terminales de rama dinámicos de las neuronas laterales ventrales etiquetadas individualmente como se demuestra. El cálculo de la dirección y la distancia de los movimientos de la rama en cada punto de tiempo permite una comparación de la dinámica de ramificación dendrítica para las neuronas laterales ventrales etiquetadas individualmente en diferentes etapas del desarrollo. El paso más importante es preservar la integridad del tejido cerebral y la morfología de dendrita durante la disección y el montaje.
La calidad de la serie de imágenes sin procesar también es fundamental para el seguimiento y la cuantificación exitosos. Usando esta técnica obtuvimos la capacidad de realizar análisis cuantitativos de la filopodia dendrita en el desarrollo de neuronas centrales de la drosofila y explorar la maquinaria molecular relacionada con la maduración de la dendrita y la sinaptogénesis.
