Questo protocollo fornisce un nuovo approccio alla quantificazione della dinamica di ramo del pergolato dendritico e allo sviluppo di neuroni utilizzando l'imaging time lapse dal vivo e un software di annotazione delle immagini 3D. Questa tecnica immagini e tiene traccia dei terminali di diramazione fornendo un metodo rapido ed efficiente per misurare i comportamenti dinamici della filopodia dendritica. La ricerca che utilizza questo metodo fornisce informazioni su come lo sviluppo e l'attività regolano la morfogenesi della dendrite.
I nostri metodi sono applicabili ai neuroni scarsamente etichettati sia in vitro che in vivo. Quando si esegue questa procedura, tenere presente che i parametri di imaging devono essere regolati con cura per ottenere una risoluzione temporale e spaziale sufficiente. Per raccogliere cervelli dalla drosofilia larvale, sotto un microscopio sezionato utilizzare una coppia di forcep di dissezione della punta standard numero cinque per tenere un esemplare larvale in posizione mentre si utilizza l'altro per sezionare attentamente il cervello, preservando i dischi degli occhi, i lobi cerebrali e il cordone nervoso ventrale.
Quindi rimuovere i muscoli attaccati per ridurre al minimo qualsiasi movimento del campione durante l'imaging. Quando tutti i cervelli sono stati raccolti, utilizzare il grasso sottovuoto per disegnare una camera quadrata su uno scivolo di vetro e aggiungere 20 microlitri di soluzione salina esterna alla camera. Usa le forcep per trasferire il cervello alla camera e regolare le posizioni del cervello al microscopio con i lati dorsali rivolti verso l'alto.
Coprire la camera con un coperchio di vetro e premere delicatamente sullo scivolo di copertura per ridurre la deriva del campione durante la procedura di imaging. Per identificare le espianto cerebrali contenenti neuroni etichettati individualmente, entro 30 minuti dalla dissezione selezionare un obiettivo di immersione in acqua 40X e una fonte di luce di epifluorescenza. Selezionare un laser a due fotoni sintonizzato su 920 nanometri e un rilevatore non Dscan e impostare i parametri di imaging per raccogliere le immagini a 512 per 512 pixel per fotogramma e un minuto per Z-stack per 10 minuti.
Quindi, regolare lo zoom ottico e digitale per ottenere una risoluzione X, Y, Z sufficiente, garantendo al contempo la copertura dell'intero pergolato dendritico entro un minuto. Le impostazioni genereranno immagini con una tipica risoluzione X, Y, Z di 0,11 per 0,11 per 0,25 micrometri. Per la correzione della deriva, aprire il file di interesse in un programma software di correzione della deriva adatto e fare clic su Modifica e modifica parametri microscopici.
Impostare il tipo di microscopio su Campo largo per le due immagini di fotoni se è disponibile un'opzione a due fotoni e seguire il flusso di lavoro definito dal software. Per la deconvoluzione, aprire l'immagine corretta per la deriva nel software di deconvoluzione e seguire il flusso di lavoro. Quindi, salva l'immagine deconvolta in un tipo di file supportato dal successivo software di annotazione delle immagini in grado di analizzare i dati 4D e segnalare le coordinate spaziali di punti definiti all'interno dell'immagine.
Per l'annotazione dell'immagine, apri l'immagine deconvolta nel software di annotazione delle immagini ed esamina e contrassegna le punte del ramo in tutti i punti del tempo in 3D. Il software di annotazione delle immagini segnala e memorizza le coordinate spaziali e temporali delle punte del ramo contrassegnate. Esportare le informazioni sulle coordinate come file CSV per i calcoli successivi.
Nel modulo Spot fare clic su Ignora creazione automatica, Modifica manualmente e selezionare la casella di controllo Connessione automatica a spot selezionato. Esaminare i fotogrammi nelle serie temporali e selezionare un ramo per l'annotazione. Tenendo premuto MAIUSC, fare clic sulla punta del terminale di diramazione per aggiungere un punto.
Quindi, fare clic sulla scheda Statistiche, selezionare Dettagli, Valori specifici e Posizione. Verranno visualizzate le informazioni sulle coordinate spaziali e temporali registrate. Fare clic su Salva per esportare i dati come file CSV.
Per calcolare il posizionamento della punta del ramo in 3D, aprire il file CSV come foglio di calcolo e selezionare la colonna TRACK ID. Fare clic su Ordina dal più piccolo al più grande e accettare Espandi la selezione. Dopo l'ordinamento, l'ID traccia identificherà ogni ramo dendritico univoco e i punti dello stesso ramo condividono lo stesso ID traccia.La colonna Ora archivierà le informazioni da diversi tempi.
Nel foglio di calcolo aggiungere una colonna Distanza e usare le coordinate per calcolare la distanza di ogni due punti adiacenti temporalemente. Per misurare movimenti minori a livello di voxel singolo, reimpostare tutti i valori di distanza inferiori a 0,3 micrometri per filtrare qualsiasi annotazione di immagine alla deriva o imperfetta non corretta. Create quindi una colonna Spostamento (Displacement) e copiate i valori dalla colonna Distanza (Distance) alla colonna Spostamento (Displacement).
Assegnare manualmente gli eventi di estensione e retrazione per ogni punta del ramo. Se si tratta di un'estensione, lasciare invariato il valore di spostamento positivo. Se si tratta di una retrazione, modificate il valore di spostamento corrispondente in un valore negativo.
Quindi, in una nuova colonna Evento, sommare i valori di spostamento per singoli eventi di estensione e retrazione. In questo video, è possibile osservare una serie di immagini proiettate ad intensità massima raccolte da un rappresentante neurone laterale ventrale etichettato individualmente. Le singole immagini cornice consentono la valutazione degli eventi di retrazione ed estensione.
Il tracciamento 4D semiautomato dei terminali di diramazione consente l'annotazione dei terminali di ramo dinamici dei neuroni ventrali laterali etichettati individualmente come dimostrato. Il calcolo della direzione e della distanza dei movimenti del ramo in ogni punto temporale consente un confronto della dinamica del ramo dendritico per i neuroni ventrali laterale etichettati individualmente in diversi stadi di sviluppo. Il passo più importante è preservare l'integrità del tessuto cerebrale e della morfolina di dendrite durante la dissezione e il montaggio.
La qualità della serie di immagini grezze è anche fondamentale per il monitoraggio e la quantificazione di successo. Utilizzando questa tecnica abbiamo acquisito la capacità di eseguire analisi quantitative della dendrite filopodia nello sviluppo dei neuroni centrali della drosofilia e di esplorare i macchinari molecolari relativi alla maturazione della dendrite e alla sinaptogenesi.
