开发技术来研究大分子在细胞核和细胞质之间的运输，并识别肿瘤抑制蛋白的不当定位，对于更深入地了解CLL发病机制和帮助开发新疗法至关重要。该协议提供了一种快速、高效的方法，用于从原生CLL细胞生成核和细胞质分数。这些分数可用于下游实验，包括酶活性测定、蛋白质解剖分析和西印迹。
这项技术将扩大我们对肿瘤内的疗法和微环境信号如何改变CLL细胞核和细胞质之间的蛋白质的穿梭以及潜在的其他B细胞恶性肿瘤的理解。此方法可用于确定蛋白质的位置和/或吸引蛋白质运动（如适用）。对计划使用的每个细胞系执行洗涤剂梯度，以确保高浓缩的核和细胞质分数的最佳生成。
除了乔迪·海和迈克尔·莫尔斯，演示这个程序将是詹妮弗·卡塞尔，一个技术员，从我的实验室。从 EDTA 血液采集管中以前同意的慢性淋巴细胞白血病患者获取外周血样本，并配以白细胞计数。人体血液样本应被视为危险，因为它们可能含有血液传播的病毒。
请确保这些样品在二类生物安全柜中处理，并且用户时刻穿着实验室外套和手套。将血液污染的材料处理在消毒剂中。如果白细胞计数等于或大于每毫升4000万细胞，则用RT CLL洗涤缓冲液以1比1的比例稀释样品。
然后等分RT密度梯度介质进入适当大小的锥形离心管中进行样品。小心地将样品分层在介质上，并在 RT 时以 400 x g 离心 30 分钟。使用塑料巴斯德移液器，轻轻收获在CLL洗涤缓冲液中密度梯度介质接口收集的单核细胞的白色层。将这种隔离的单层转移到一个新的50毫升锥形离心管中。
要清洗细胞，请将40毫升CLL洗涤缓冲液加入此单层，并在室温下以300 x g离心10分钟。丢弃上清液，轻拂管的底部以重新悬浮颗粒，然后重复此洗涤。丢弃上清液，再次轻拂管的底部，然后根据颗粒的大小在一定体积的 CLL 洗涤缓冲液中重新悬浮细胞颗粒。
计数细胞后和流式细胞测量后检查细胞纯度，将细胞放入组织培养板，在所需的细胞密度准备刺激或药物治疗。经过刺激和/或药物治疗，孵育完成。将细胞转移到单独标记的1.5毫升微混管和颗粒中，在4摄氏度下以200xg离心5分钟。
丢弃上清液后，用磷酸酶抑制剂将细胞颗粒重新悬浮在一毫升冰冷的PBS中。在摄氏4度下以200xg离心5分钟。去除上一液，将这些全细胞提取颗粒留在冰上，作进一步准备。
要准备细胞质分数，轻轻将细胞颗粒重新悬浮在50微升1x超音速缓冲液中。为了让细胞膨胀，在冰上孵育15分钟。执行洗涤剂梯度以确定用于特定细胞类型的洗涤剂的最佳浓度后，在每个样品中加入 0.8 至 2.5 微升洗涤剂，并在最高设置上旋转 10 秒。
要验证细胞解解，在添加洗涤剂之前和之后，在相位对比显微镜下观察细胞。所有细胞都有一个密集的暗核，被细胞质包围，以明亮的光环出现。一旦磨水，在4摄氏度下以14，000xg离心30秒。
小心，不干扰颗粒，将上先液转移到预冷却标记的微模糊管中，并在 80 摄氏度下储存此细胞质分数，直到进一步分析。确保完全去除细胞质分数，以防止核部分受到污染。在含有核分数的剩余颗粒中，加入50微升完整的解液缓冲液，然后通过上下移液重新悬浮。
要溶解与核膜相关的蛋白质，加入2.5微升洗涤剂，在最高设置上旋转10秒，在冰上孵育30分钟。最高设置上的涡流为 30 秒，然后离心。然后将上半液转移到预冷却标记的微模糊管中，并在80摄氏度下储存该核部分，直到进一步分析。
对于全细胞解液，通过上下移液，将整个细胞提取颗粒重新悬浮在100微升完整解合缓冲液中。为确保完整的细胞解解，加入5微升洗涤剂，在冰上孵育30分钟。漩涡在最高设置30秒，然后在14，000 x g的离心机在4摄氏度下20分钟。
将上一液转移到预冷却的微模糊管中，并在80摄氏度下储存整个细胞，直到进一步分析。要量化核质和细胞质分数之间的蛋白质贩运，进行定量的西方印迹分析并导入图像。若要在图像功能区中显示图像，请单击"显示"组中的"选择"按钮，然后单击"化学通道"。
将打开"选择显示"对话框，以便必要时进行进一步调整。使用图像 LUT 选项卡上的可调滑块（包括亮度或对比度）实现其他增强功能。使用"曲线"选项卡进行更精细的调整。
对于数据分析，首先单击分析功能区。若要仅分析一个频道，请通过单击频道的"不显示频道缩略图"取消选择未分析的频道，只显示所需的频道。要量化信号强度，请单击"添加矩形"以向图像添加矩形。
单击要素的中心（如蛋白质带）以围绕它放置一个矩形。添加所需形状后，单击"选择"将光标返回到选择工具。要减去背景噪音，请单击"背景"组中的第一个按钮，然后从下拉菜单中选择"中位数"。
在"背景"对话框中将边框宽度设置为 3，并选择最适合用于背景计算的图像背景的段。要导出数据，请单击表上方的"形状"选项卡。对于密度测定，信号列中的值是必需的。
信号是形状像素强度值或总计减去区域中背景的度值的总和。然后单击"报告"按钮，单击"另存为"或"启动电子表格"。要计算保存电子表格中每个平面或变量感兴趣的蛋白质的规范化表达，将感兴趣的蛋白质获得的信号除以相应蛋白质载荷控制带的信号。
要导出图像，请单击表格上方的"图像"选项卡，然后单击要导出的图像。如果将图像用于幻灯片演示文稿或其他数字格式，请单击软件图标，将鼠标悬停在"导出"上，单击数字媒体的图像，然后按要求保存图像。使用密度离心使 WCC 大于 4000 万的 CLL 细胞富集可实现高细胞恢复。
FSC和SSC的浇注后通过流式细胞学对样品进行分析，发现CLL细胞的纯度超过95%，如CLL细胞标记、CD19和CD5的双表面表达所示。当对CLL细胞系、Mac-1和原发性CLL细胞的结果分数进行免疫印迹时，分馏表明Mac-1细胞的最佳洗涤剂水平为1至60稀释，而原发性CLL细胞的稀释程度为1至30。当FOXO1在核和细胞质分质中确定在Mac-1和原发性CLL细胞中的亚细胞定位时，在细胞质分数中几乎排他性地表达核和β图布林的层压，显示了高浓缩分数的生成。
与NDC相比，AZD 8055治疗后，在细胞质中，FOXO1表达减少，同时在核舱中增加FOXO1表达，从而表明蛋白质易位。在五个原 CLL 样本的单个免疫印迹在亚细胞分数内进行量化后，AZD 8055 被发现可降低细胞质中FOXO1表达的水平，并增加细胞核中的表达。BCR交链接增加细胞质FOXO1表达。
请记住，所有试剂和样品都放在冰上，以防止蛋白质降解。在这个程序中产生的亚细胞分数也可用于酶活性测定，如FOXO活性测定，这使得FOXO1的细胞位置与其DNA结合活性之间能够绘制出平行线。这项技术的发展使我们能够解决CLL细胞内特定蛋白质的贩运问题，以回应选择性抑制剂，并支持我们的平行免疫荧光研究，以生成一个强大且可量化的数据集。
