Makromoleküllerin çekirdek ve sitoplazma arasındaki ulaşımını araştırmak için teknikler geliştirmek ve tümör baskılayıcı proteinlerin yanlış lokalizasyonunu belirlemek, CLL patogenezinin daha derin anlaşılması ve yeni tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olmak için esastır. Bu protokol, birincil CLL hücrelerinden nükleer ve sitoplazmik fraksiyonlar üretmek için hızlı ve verimli bir yöntem sağlar. Bu kesirler enzim aktivitesi tahlilleri, proteomik analiz ve batı lekeleme dahil olmak üzere downstream deneylerde kullanılabilir.
Bu teknik, tümörlerdeki tedavilerin ve mikro-çevresel sinyallerin CLL hücrelerinde ve potansiyel olarak diğer B hücre malignitelerinde çekirdek ve sitoplazma arasındaki proteinlerin kapatılmasını nasıl değiştirdiği ne anlama gelen anlayışımızı genişletecektir. Bu yöntem proteinlerin yerini belirlemek ve/veya protein hareketini mümkün olduğunca çekmek için kullanılabilir. Yüksek oranda zenginleştirilmiş nükleer ve sitoplazmik fraksiyonların en iyi neslini sağlamak için kullanmayı planladığınız her bir hücre hattında bir deterjan degradesi gerçekleştirin.
Jodie Hay ve Michael Moles'in yanı sıra, bu prosedürü gösteren Jennifer Cassels, laboratuvarımdan bir teknisyen. EDTA kan toplama tüplerinde daha önce rıza gösterilmiş kronik lenfositik lösemi hastalarından, beyaz hücre sayımı eşliğinde periferik kan örnekleri alın. İnsan kanı örnekleri potansiyel olarak kan yoluyla bulaşan virüsler içerdiğinden tehlikeli olarak kabul edilmelidir.
Lütfen bu örneklerin ikinci sınıf bir biyo-güvenlik kabininde işlendiğinden ve kullanıcının her zaman bir laboratuvar önlüğü ve eldiven giydiğinden emin olun. Kanla kirlenmiş maddeleri dezenfektanlara atın. Beyaz hücre sayısı mililitre başına 40 milyon hücreye eşit veya daha fazlaysa, örneği RT CLL yıkama tamponuyla bire bir oranında seyreltin.
Daha sonra numune için uygun büyüklükte konik santrifüj tüpü içine RT yoğunluk gradyan orta aliquot. Numuneyi rt'de 30 dakika boyunca 400 x g'da orta ve santrifüjün üzerine dikkatlice katlayın. Plastik bir Pasteur pipet kullanarak, cll yıkama tamponundaki yoğunluk gradyan ortamının arabiriminde toplanan mononükleer hücrelerin beyaz tabakasını nazikçe hasat edin. Bu izole monolayer taze bir 50 mililitrekonik santrifüj tüp içine aktarın.
Hücreleri yıkamak için, bu monolayer ve santrifüj 300 x g oda sıcaklığında 10 dakika 40 mililitre CLL yıkama tampon ekleyin. Supernatant atın, pelet yeniden askıya almak için tüpün alt flick ve bu yıkama tekrarlayın. Supernatant atın, tekrar tüpün alt flick ve sonra pelet boyutuna bağlı olarak CLL yıkama tampon bir dizi hacim hücre pelet yeniden askıya.
Hücreleri sayma ve hücre saflığını kontrol etmek için akış sitometri sonra, gerekli hücre yoğunluğu uyarılma veya ilaç tedavisi için hazır doku kültür plakaları içine hücreleri yerleştirin. Stimülasyon ve/veya ilaç tedavisinden sonra kuluçka işlemi tamamlanır. Hücreleri tek tek etiketlenmiş 1,5 mililitrelik mikrofuge tüplere ve peletlere, 200 x g'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüj ederek aktarın.
Supernatant attıktan sonra, fosfataz inhibitörleri ile buz gibi PBS bir mililitre hücre pelet yeniden askıya. Santrifüj 200 x g'de dört santigrat derecede beş dakika. Supernatant çıkarın ve daha fazla hazırlıklar için buz üzerinde bu bütün hücre özü pelet tutmak.
Sitoplazmik fraksiyonları hazırlamak için, hücre peletlerini 50 mikrolitrelik 1x hipertonik tamponda hafifçe askıya alın. Hücrelerin şişmesine izin vermek için, onları 15 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın. Belirli bir hücre tipi için kullanılacak en uygun deterjan konsantrasyonunu belirlemek için bir deterjan degradesi yaptıktan sonra, her numuneye 0,8 ila 2,5 mikrolitre deterjan ekleyin ve en yüksek ayara 10 saniye boyunca girdap ekleyin.
Hücre lisisini doğrulamak için, deterjan ilavesinden önce ve sonra faz kontrastmikroskobu altında hücreleri gözlemleyin. Tüm hücrelerin parlak bir hale olarak görünen sitoplazma ile çevrili yoğun, koyu bir çekirdeği vardır. Bir kez lysed, 4 santigrat derece 30 saniye için 14, 000 x g de santimetre.
Dikkatle, pelet rahatsız etmeden, önceden soğutulmuş etiketli mikrofuge tüp içine supernatant aktarın ve daha fazla analiz kadar 80 santiplazmak fraksiyonu saklayın. Nükleer fraksiyonun kontaminasyonunu önlemek için sitoplazmik fraksiyonun tamamen çıkarılmasını sağlayın. Nükleer fraksiyonu içeren kalan pelet için, tam lysis tampon 50 mikrolitre ekleyin ve yukarı ve aşağı borulama tarafından yeniden askıya.
Nükleer membran ile ilişkili proteinleri yatıştırmak için, 2,5 mikrolitre deterjan, 10 saniye boyunca en yüksek ayarda girdap ve 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka. Girdap 30 saniye ve santrifüj için en yüksek ayarı. Sonra supernatant önceden soğutulmuş etiketli mikrofuge tüp içine aktarın ve daha fazla analiz kadar 80 santigrat derece bu nükleer kesir saklamak.
Tüm hücre lisates için, yukarı ve aşağı borulama tarafından tam lysis tampon 100 mikrolitre tüm hücre özü pelet yeniden askıya. Tam hücre lisis sağlamak için, deterjan beş mikrolitre ekleyin ve 30 dakika buz üzerinde kuluçka. Girdap 30 saniye için en yüksek ayarı ve daha sonra 14, 000 x g dört santigrat derece 20 dakika santrifüj.
Supernatant'ı önceden soğutulmuş bir mikrofuge tüpüne aktarın ve daha fazla analiz edinceye kadar tüm hücre lisatını 80 derecede saklayın. Nükleer ve sitoplazmik fraksiyonlar arasındaki protein ticaretini ölçmek için, sayısal batı leke analizi yapmak ve görüntüleri ithal. Resmi Resim şeridinde görüntülemek için, Görüntü grubundaki Seç düğmesini tıklatın ve Chemi Channel'ı tıklatın.
Gerekirse daha fazla ayarlama yapabilmek için Ekranı Seç iletişim kutusu açılır. Parlaklık veya kontrast dahil olmak üzere görüntü LUT sekmesinde ayarlanabilir kaydırıcıları kullanarak ek geliştirmeler uygulayın. Daha hassas ayarlamalar için Eğriler sekmesini kullanın.
Veri analizi için önce Çözümleme şeridini tıklatın. Yalnızca bir kanalı çözümlemek için, bir kanalın Kanal Gösterme küçük resmine tıklayarak analiz edilmeyen kanalları seçin ve yalnızca istenen kanalı görüntüleyin. Sinyal yoğunluğunu ölçmek için, görüntüye dikdörtgen eklemek için Dikdörtgen Ekle'yi tıklatın.
Etrafında bir dikdörtgen yerleştirmek için protein bandı gibi bir özelliğin ortasını tıklatın. İstenilen şekilleri ekledikten sonra imleci seçim aracına döndürmek için Seç'i tıklatın. Arka plan gürültüsünü çıkarmak için Arka Plan grubundaki ilk düğmeyi tıklatın ve açılır menüden Ortanca'yı seçin.
Kenarlık genişliğini Arka Plan iletişim kutusunda üçe ayarlayın ve arka plan hesaplamasında kullanılacak görüntü arka planını en iyi temsil eden kesimleri seçin. Verileri dışa aktarmak için tablonun üzerindeki Şekiller sekmesini tıklatın. Densitometri için Sinyal sütunundaki değerler gereklidir.
Sinyal, piksel yoğunluğu değerlerinin veya bir şeklin toplamının toplamıdır. Ardından Rapor et düğmesini tıklatın, Farklı Kaydet veya Elektronik Tabloyu Başlat'ı tıklatın. Kaydedilen elektronik tablodaki her düzlem veya değişken için ilgi proteininin normalleştirilmiş ifadesini hesaplamak için, ilgili protein yükleme kontrol bandı için verilen sinyalle ilgi proteini için elde edilen sinyali bölün.
Resmi dışa aktarmak için, tablonun üzerinde bulunan Resimler sekmesini tıklatın ve sonra dışa aktarılacak resmin üzerine tıklayın. Slayt sunusu veya diğer dijital biçimler için görüntüyü kullanıyorsanız, yazılım simgesini tıklatın, Dışa Aktarma'nın üzerine tıklayın, Dijital Medya için Resim'e tıklayın ve ardından görüntüyü gerektiği gibi kaydedin. Yoğunluk santrifüjü kullanarak mililitre başına 40 milyondan fazla WCC ile CLL hücrelerinin zenginleşmesi yüksek hücre kurtarma sağlar.
FSC ve SSC'ye geçtikten sonra kalıbın akış sitometrisi ile incelenmesi, CLL hücrelerinin saflığının CLL hücre belirteçleri, CD19 ve CD5'in çift yüzey ekspresyonunda belirtildiği gibi %95'ten fazla olduğunu ortaya koymaktadır. CLL hücre hattı, Mac-1 ve primer CLL hücrelerinin ortaya çıkan fraksiyonlarında immün lekeler yapıldığında, fraksiyonasyon Mac-1 hücreleri için en uygun deterjan seviyesinin primer CLL hücreleri için 1 ila 30 arasında seyreltme olduğunu göstermiştir. Nükleer ve sitoplazmik fraksiyonlarda FOXO1'in subsellüler lokalizasyonu Mac-1 ve primer CLL hücrelerinde belirlendiğinde, yüksek oranda zenginleştirilmiş fraksiyonların üretimi, sitoplazmik fraksiyonlarda nükleer ve beta Tubulin'in neredeyse münhasır ekspresyonu ile gösterilmiştir.
AZD 8055 ile yapılan tedavi sonrasında sitoplazmada FOXO1 ekspresyonu azalmış, ndc ile karşılaştırıldığında, nükleer bölmede FOXO1 ekspresyonunda artış eşlik ederek protein translokasyonunun gösterilmesi ile birlikte. Beş primer CLL örneğindeki bireysel immünolekeler in hücre altı fraksiyonları içinde ölçüldükten sonra AZD 8055'in sitoplazmadaki FOXO1 ekspresyonu düzeylerini azalttığı ve çekirdekteki ifadeyi artırıldığı saptandı. BCR çapraz bağlantı artmış sitoplazmik FOXO1 ekspresyonu.
Protein bozulmasını önlemek için tüm reaktifleri ve numuneleri buzda tutmayı unutmayın. Bu işlemde üretilen hücre altı fraksiyonları, FOXO1'in hücresel konumu ile DNA bağlama aktivitesi arasında paralellikler çizilmesini sağlayan FOXO aktivitesi tahlilleri gibi enzim aktivitesi denemelerinde de kullanılabilir. Bu tekniğin geliştirilmesi, seçici inhibitörlere yanıt olarak CLL hücrelerinde spesifik proteinlerin ticaretini ele almamızı sağlamıştır ve sağlam ve ölçülebilir bir veri seti oluşturmak için paralel immünoffloresan çalışmalarımızı desteklemektedir.
