핵과 세포질 사이 거대 분자의 수송을 조사하는 기술을 개발하고, 종양 억제제 단백질의 잘못된 지역화를 확인하는 것은 CLL 병인의 깊은 이해를 얻고 새로운 치료의 발달에 있는 원조에 필수적입니다. 이 프로토콜은 1차 CLL 세포로부터 핵 및 세포질 분수를 생성하는 빠르고 효율적인 방법을 제공합니다. 이러한 분획은 효소 활성 분석, 프로테오믹 분석 및 서부 블로팅을 포함한 다운스트림 실험에서 사용될 수 있다.
이 기술은 종양 내의 치료와 미세 환경 신호가 CLL 세포및 잠재적으로 다른 B 세포 악성종양에 있는 핵과 세포질 사이 단백질의 폐쇄를 어떻게 바꾸는지에 대한 우리의 이해를 넓힐 것입니다. 이 방법은 단백질의 위치를 결정하고/또는 해당되는 단백질 운동을 유치하는 데 사용될 수 있다. 고농축 핵 및 세포질 분획의 최적의 생성을 보장하기 위해 사용할 각 개별 세포주에 세제 그라데이션을 수행합니다.
조디 헤이와 마이클 몰스와 함께, 이 절차를 시연하는 것은 제니퍼 카셀, 내 실험실에서 기술자가 될 것입니다. 이전에 동의된 만성 림프구성 백혈병 환자로부터 백혈구 수를 수반하는 EDTA 혈액 수집 관에서 말초 혈액 샘플을 채취하십시오. 인간의 혈액 샘플은 잠재적으로 혈액 매개 바이러스를 포함하기 때문에 위험한 것으로 간주되어야합니다.
이러한 샘플은 클래스 2 바이오 안전 캐비닛에서 처리되고 사용자가 항상 실험실 코트와 장갑을 착용하고 있는지 확인하십시오. 소독제에 혈액오염 물질을 폐기하십시오. 백혈구 수가 밀리리터당 4천만 개 이상의 세포인 경우 RT CLL 세척 버퍼를 사용하여 샘플을 1대 1의 비율로 희석합니다.
그런 다음 ALIquot RT 밀도 그라데이션 배지를 샘플에 적합한 크기의 원심 분리기 튜브로 넣습니다. RT에서 30분 동안 중간 및 원심분리기 위에 샘플을 400 x g로 조심스럽게 레이어링합니다. 플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용하여 CLL 세척 버퍼에서 밀도 그라데이션 배지의 인터페이스에서 수집한 단일 핵 세포의 백색 층을 부드럽게 수확합니다. 이 고립된 단층은 신선한 50밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기.
세포를 세척하려면 이 단층층과 원심분리기에 40밀리리터의 CLL 세척 버퍼를 300 x g로 실온에서 10분간 추가합니다. 상체를 버리고 튜브 바닥을 쓸어 다시 펜탈을 중단하고이 세척을 반복하십시오. 상체를 버리고 튜브의 바닥을 다시 쓸어 낸 다음 펠릿의 크기에 따라 CLL 세척 버퍼의 세트 부피에서 셀 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
세포를 세고 혈중 세포 종량제 후 세포 순도를 검사한 후, 자극 또는 약물 치료를 위해 준비된 필요한 세포 밀도로 세포를 조직 배양 판에 배치한다. 자극 및 /또는 약물 치료 후, 인큐베이션이 완료됩니다. 세포를 개별적으로 표지된 1.5밀리리터 미세분리관과 펠릿으로 옮기면 섭씨 4도에서 5분간 200 x g에서 원심분리를 합니다.
상체를 폐기한 후, 인산염 억제제로 얼음처럼 차가운 PBS 의 1밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 섭씨 4도에서 5분간 200 x g의 원심분리기. 상체를 제거하고 추가 준비를 위해 이 전체 세포 추출물 펠릿을 얼음 위에 보관하십시오.
세포질 분획을 준비하려면 1x 고토닉 버퍼의 50 마이크로리터에서 셀 펠릿을 부드럽게 다시 중단합니다. 세포가 팽창할 수 있도록 15분 동안 얼음에 배양하십시오. 특정 세포 유형에 사용할 세제의 최적 농도를 결정하기 위해 세제 그라데이션을 수행한 후, 10초 동안 가장 높은 설정에서 각 시료 및 소용돌이에 0.8~2.5 마이크로리터의 세제를 추가한다.
세포 리시스를 확인하려면 세제 를 첨가하기 전과 후에 위상 대비 현미경으로 세포를 관찰하십시오. 모든 세포에는 밝은 후광으로 나타나는 세포질로 둘러싸인 조밀하고 어두운 핵이 있습니다. 일단 lysed, 원심 분리시 시료14, 000 x g에 30 초 4 섭씨에서 초.
조심스럽게, 펠릿을 방해하지 않고, 미리 차가운 라벨 마이크로 푸지 튜브로 상체를 전송하고 추가 분석까지 80섭씨에서이 세포질 분획을 저장합니다. 핵 분수의 오염을 방지하기 위해 세포질 분획을 완전히 제거하십시오. 핵 분획을 포함하는 나머지 펠릿에 50마이크로리터의 완전한 리시스 버퍼를 추가하고 위아래로 파이펫팅하여 다시 중단합니다.
핵막과 관련된 단백질을 용해시키기 위해 2.5 마이크로리터의 세제, 10초 동안 가장 높은 설정에 소용돌이를 추가하고 30분 동안 얼음에 배양합니다. 30초 동안 가장 높은 설정의 소용돌이와 원심분리기. 그런 다음 상체를 미리 냉각된 마이크로퍼지 튜브로 옮기고 추가 분석이 될 때까지 이 핵 분획을 섭씨 80도에 저장합니다.
전체 셀 용해물의 경우, 전체 셀 추출물 펠릿을 100 마이크로리터의 완전한 리시스 버퍼에서 위아래로 피펫팅하여 다시 중단하십시오. 완전한 세포 용해를 보장하기 위해 세제 5 마이크로리터를 넣고 얼음에 30분 동안 배양합니다. 30초 동안 가장 높은 설정의 소용돌이와 섭씨 4도에서 20분 동안 14, 000 x g의 원심분리기.
상체를 미리 냉각된 미세분리관으로 옮기고 이 전체 세포를 추가 분석전까지 섭씨 80도에 보관하십시오. 핵과 세포질 분수 사이의 단백질 인신 매매를 정량화하려면 정량적 서부 얼룩 분석을 수행하고 이미지를 가져옵니다. 이미지 리본에 이미지를 표시하려면 디스플레이 그룹의 선택 단추를 클릭하고 Chemi 채널을 클릭합니다.
필요한 경우 추가 조정을 위해 디스플레이 선택 대화 상자가 열립니다. 밝기 또는 대비를 포함하여 이미지 LUT 탭의 조정 가능한 슬라이더를 사용하여 추가 향상된 기능을 구현합니다. 곡선 탭을 사용하여 더 미세조정합니다.
데이터 분석을 위해 먼저 분석 리본을 클릭합니다. 하나의 채널만 분석하려면 채널의 채널 미리보기 이미지를 클릭하여 분석되지 않는 채널을 선택 해제하고 원하는 채널만 표시합니다. 신호 강도를 정량화하려면 사각형 추가를 클릭하여 이미지에 사각형을 추가합니다.
단백질 밴드와 같은 피처의 중심을 클릭하여 사각형을 배치합니다. 원하는 셰이프를 추가한 후 선택 선택을 클릭하여 커서를 선택 도구에 반환합니다. 배경 노이즈를 빼려면 배경 그룹의 첫 번째 단추를 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 중앙값을 선택합니다.
배경 대화 상자에서 테두리 너비를 세 가지로 설정하고 배경 계산에 사용할 이미지 배경을 가장 잘 나타내는 세그먼트를 선택합니다. 데이터를 내보내려면 테이블 위의 셰이프 탭을 클릭합니다. 밀도의 경우 신호 열의 값이 필요합니다.
신호는 영역의 배경 의 생성물을 뺀 셰이프에 대한 픽셀 강도 값 또는 합계의 합입니다. 그런 다음 보고서 버튼을 클릭하고 저장을 클릭하거나 스프레드시트를 시작합니다. 저장된 스프레드시트 내의 각 평면 또는 변수에 대한 관심 있는 단백질의 정규화된 발현을 계산하기 위해, 해당 단백질 로딩 제어 대역에 대한 신호에 의해 관심 있는 단백질에 대한 얻어진 신호를 나눕니다.
이미지를 내보려면 테이블 위에 있는 이미지 탭을 클릭한 다음 내보낼 이미지를 클릭합니다. 슬라이드 프레젠테이션 또는 기타 디지털 형식에 이미지를 사용하는 경우 소프트웨어 아이콘을 클릭하고 내보내기 위로 마우스를 가져가고 디지털 미디어의 이미지를 클릭한 다음 필요에 따라 이미지를 저장합니다. 밀도 원심분리를 사용하여 밀리리터당 4천만 개 이상의 WCC를 가진 CLL 세포의 농축은 높은 세포 복구를 가능하게 합니다.
FSC 및 SSC에서 게이팅 후 유량 세포측정에 의한 시료의 분석은 CLL 세포 마커, CD19 및 CD5의 이중 표면 발현에 의해 표시된 바와 같이 CLL 세포의 순도가 95% 이상인 것을 나타낸다. 면역 블롯이 CLL 세포주, Mac-1 및 1차 CLL 세포의 결과 분획에서 수행되었을 때, 분획은 Mac-1 세포에 대한 최적의 세제 수준이 1-60 희석에 있었다는 것을 나타내었으며, 1차 CLL 세포에 대해 1~30과 비교하였다. 핵 및 세포질 분획에서 FOXO1의 세포 세포 소소화가 Mac-1 및 1차 CLL 세포에서 결정되었을 때, 세포질 분획에서 핵 및 베타 투룰린에서 라민의 거의 독점적인 발현에 의해 고농축 분수의 생성이 나타났다.
FOXO1 발현은 NDC에 비해 AZD 8055로 치료한 후 세포질에서 감소되었으며, 핵구획에서 FOXO1 발현의 증가를 동반하여 단백질 전좌를 입증했다. 5개의 1차 CLL 샘플로부터의 개별 면역 블롯이 세포극 분획 내에서 정량화된 후, AZD 8055는 세포질에서 FOXO1 발현의 수준을 감소시키고 핵에서 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. BCR 교차 연결 증가 세포질 FOXO1 발현.
단백질 분해를 방지하기 위해 모든 시약과 샘플을 얼음에 보관해야 합니다. 이 절차에서 생성된 세포 외 분획은 FOXO1의 세포 위치와 DNA 결합 활성 사이에 평행선을 그릴 수 있게 하는 FOXO 활동 분석과 같은 효소 활성 분석에도 사용될 수 있다. 이 기술의 발달은 선택적인 억제제에 응하여 CLL 세포 내의 특정 단백질의 인신 매매를 해결하고 우리의 병렬 면역 형광 연구를 지원하여 견고하고 정량화 가능한 데이터 세트를 생성할 수 있게 했습니다.
