该协议旨在发现卵巢组织中的细菌并预测其功能。免疫造血化学染色和16S rRNA测序，用于发现和区分原位癌和非癌卵巢组织的细菌。通过重建未观察到的日子，通过对社区的BOP和细胞遗传调查来预测细菌的补偿和功能差异。
我们的协议旨在从卵巢组织中提取细菌。它也可用于发现任何种类的肿瘤中的细菌。我们协议的主要优点是它简单方便，几乎每个实验室都能实现。
获得结果也很快。在协议中的练习中，重要的是排除任何细菌异位肿瘤组织。因此，本协议中的所有程序都需要无菌。
在手术过程中，用一对新的无菌钳将卵巢分离成大约一厘米厚的组织样本。在整个过程中避免触摸任何其他内容。分离后，将样品取出到无菌管中，放入液氮中进行传输。
将样品保存在零下80摄氏度。用正式组织修复组织，然后用石蜡嵌入组织。此协议可以在此处暂停。
组织可以保存在室温下以进行更长的保存。为了进一步操作，将样品切成五微米序列部分。然后，干燥样品。
对样品进行脱石蜡和补液。要检索抗原，需要在EDTA缓冲区进行10分钟的微波处理。将样品浸入含有0.3%氢气的PBS中。
过氧化20分钟，以阻止内源性过氧化酶活动。在 LPS 核心执行抗体 EMA，浓度为 1 超过 300。并在摄氏四度下维持一晚。
为了发现细菌，使用 DAP 基板套件来检测 HRP 的存在。根据制造商的说明，使用 HRP 聚合物、抗兔抗体。使用表浓缩器让抗体完全结合。
使用 PBS 消除未组合的抗体。按照制造商的说明进行化学染色，然后将样品冲洗到水下。对样品脱水。
通过签名来套取样品。并根据制造商的协议使用成像 Pro Plus 准备库作为示例输入。练习引物模式，该模式由基因特异性序列和 Illumina 适配器悬空核苷酸序列组成。
为了放大rRNA基因序列中细菌16sV4区域的出生率，使用放大PCR放大DNA样本输入的模板。使用 Mag-Bind RxNPure 加磁珠从 PCR 产品中去除反应组合。第二次执行指数化 PCR 放大。
使用安捷伦 2200 磁带站检查库。使用量子流 dsDNA 系统对库进行量化。v3 标准流细胞具有 600 个周期，可产生大约 100，000 个配对端。
2 倍 300 基 3.图书馆是去规范化、集中化和排序的。每个样品的原始速率根据修剪的测序质量进行过滤。
应同时删除引物和适配器序列。序列读取与对和质量低于25应缩短。通过软件包 QIIME 分析 16s rRNA。
收集序列以形成具有相似性截止值的 OTUs，对于 OTUs，应在每个样本中计算相对丰度。使用 Bayesian 分类器，该分类器在 RDP 培训集中对所有序列进行排序。在给定的 OTU 中，将具有序列主要一致性的分类分配给 OTU。
OTUs 基于样本组信息与席尔瓦数据库对齐。执行字母多样性和基于 UniFrac 的主要坐标分析。要预测相关说明细菌的特征，请使用 BugBase。
预测 PICRUST 的元基因组的功能组成。使用监控数据和包含参考基因组的数据库，在 STAMP 软件的帮助下分析每个组之间的不同功能。使用一个统计软件来计算结果。
统计意义的指示应设定为 p 小于 0.05。通过学生的 t 测试计算混淆因素（包括年龄和均等值）。通过Chi-square测试计算更年期状况、高血压史和糖尿病。
通过曼-惠特尼 U 测试计算卵巢细菌分类数。16名患者参加了这项研究。BugBase 用于对预测的元信息进行实践分析。
使用抗菌LPS抗体的卵巢的潜在病原体和免疫造血术。这个数字显示了癌症和对照组的细菌丰富性和多样性。通过 16S rRNA 测序显示。
这些数字是观察到的物种指数。超1指数、ACE指数、香农指数、均匀指数、辛普森指数。卵巢样本中植物的相对丰度和12种最丰富的细菌物种如图所示。
图A、B、C和D表示对照组患者卵巢和卵巢癌组中面板的相对丰度。对照患者卵巢和卵巢癌组12种最丰富的细菌的相对丰度。这是最常见的，使用PCoA和相对丰度的氧纳龙西比里库姆和梅萨诺萨尔西纳真空。
图 A 显示了使用 PCOA 聚类的最常见值。PC1 和 PC2 绘制在 x 和 y 轴上。红块等于卵巢癌组的样本。
蓝色圆等于对照组中的示例。卵巢癌组的样本可以从对照组的其他样本中分离出来。图 B 显示了使用 PCOA 聚类的最常见。
PC1 和 PC2 绘制在 x 和 y 轴上。红色块等于卵巢癌组的样本。蓝色固体圆等于子宫肌瘤患者的样本。
蓝色空心圆等于子宫腺瘤患者的样本。图 C 显示了氧纳龙西比里库姆的相对丰度。图 D 是梅萨诺萨尔西娜真空。
这个数字是预测的元基因组学的BugBase分析。癌症组卵巢的潜在致病性和氧化抗压表型强于对照组。通过PICRUSt分析，这个数字与癌症和对照组之间的KEGG路径空间有显著差异。
当我们得到我们的样品，一对新的无菌钳子是需要的。注意样品的潜在污染。这种细菌的异地肿瘤组织可能会极大地影响解决。
首选将控制组设置为每个步骤。为了减少潜在污染的影响。
