シアノバクテリアは、合成生物学や再生可能なバイオテクノロジーアプリケーションに有用なプラットフォームとしてますます認識されている光合成微生物の重要なフィラムです。したがって、異種DNAを異なるシアノバクテリア種に設計、クローニング、導入を簡素化するための堅牢な技術を開発することが重要です。したがって、この技術は、自然に変換できないシアノバクテリア種にDNAを導入するための結合または三親交配と呼ばれる確立された方法を実証する。
結合は単細胞から多細胞糸状体種へのシアノバクテリア株の広い配列で正常に行われている。初めてこの技術を試みている場合は、シアノバクテリアと大腸菌の両方を注意して扱ってください。たとえば、プロトコルで指定された値を上回る遠心分離は行わないし、渦を巻かないでください。
細菌とシアノバクテリアを混合することは、初めてのユーザーには奇妙に思えるかもしれません.私たちは、活用プロセスを実証することによって、これを明確にするために役立つことを願っています。レベル 1 のアセンブリを構築した後、適切なレベルの T アクセクター ベクターを選択します。
適切な終了リンクを選択して、最終レベル 1 アセンブリの 3 つの素端をレベル T バックボーンにリゲートします。レベル T で 1 つ以上のレベル 1 のアセンブリを組み立てるには、PBI1 と必要なエンド リンク ベクタとの反応ミックスを準備します。サーマルサイクラープログラムを設定し、原稿に従って進めます。
初日には、シネコシスティスPCC 6803またはシネココッカス・エロンガトゥス・ユートックス2973の新鮮な培養を設定することにより、シアノバクテリア培養を成長させます。熱無菌ループで、無菌BG-11寒天プレートから細胞を削り取り、50ミリリットルの新鮮なBG-11培地で満たされた100ミリリットルの円錐形フラスコに入れて接種します。フラスコを照明付きの振盪インキュベーターに入れ、100 RPMで摂氏30度でシネコシスティスPCC 6803細胞培養を成長させます。
シネコクス・エロンゲタスUTEX 2973の場合、細胞培養物を摂氏400度で100RPMで成長させます。1~2日後、細胞培養の1ミリリットルを引き、分光光度計で測定する。OD 750の吸光度は0.5から1.5に達する。
2日目に、1ミリリットル当たり100マイクログラムの濃度でアンピシリンとクロラムフェニコールの濃度で5ミリリットルのLB培地中のベクターPRK24およびPRL528を含むMC1061大腸菌ヘルパー株を接種する。揺れインキュベーターで225 RPMで一晩摂氏37度で成長します。次に、レベルT貨物ベクターを運ぶ大腸菌培養で適切な抗生物質を含むLB培地の5ミリリットルを接種する。
揺れインキュベーターで225 RPMで一晩摂氏37度で培養を成長させます。3日目には、ヘルパーと貨物大腸菌の一晩培養物を室温で10分間10分間遠心分離します。細胞ペレットを乱さずに上清を捨てます。
抗生物質を使わずに新鮮なLB培地を5ミリリットル加えてペレットを洗います。ペレットを上下に軽くピペット化し、遠心分離機を軽くピペットして上清を取り除きます。この洗浄工程を3回繰り返して、一晩培養から残留抗生物質を除去する。
最後の洗浄後、細胞ペレットを初期培養体積のLB培地の半分の体積で再懸濁する。その後、ヘルパー株の450マイクロリットルを2ミリリットルチューブ内の貨物株450マイクロリットルと組み合わせ、室温で放置します。次に、シアノバクテリア培養物を1ミリリットルで1ミリリットル室温で10分間500g遠心してシアノバクテリア培養を調製する。
その後、細胞ペレットを邪魔することなく慎重に上清を捨てます。同じ初期ボリュームの新鮮なBG-11培地を加えてペレットを4回洗浄します。洗浄したシアノバクテリア培養液の900マイクロリットルを、2ミリリットルチューブ内の結合された大腸菌株の900マイクロリットルに加える。
上下に軽くピペットを入れ、文化を混ぜます。シネコシスティスPCC 6803または2時間の間、室温で混合物を30分間インキュベートします。混合物を室温で1,500gで10分間遠心する。
上清の1.6ミリリットルを除去し、残りの上清のペレットを再懸濁します。抗生物質なしでLB BG-11寒天プレートに1つの0.45ミクロン膜フィルターを置きます。滅菌スプレッダーまたは無菌曲げ先端で膜上に大腸菌/シアノバクテリア培養液の200マイクロリットルを慎重に広げます。
パラフィンフィルムでプレートを密封し、プレートを照らされたインキュベーターに24時間置きます。24時間後、炎殺菌鉗子を用いて膜を、適切な抗生物質を含む新鮮なBG-11寒天プレートに慎重に移動し、貨物ベクターを選択します。パラフィンフィルムでプレートを密封し、コロニーが現れるまで以前と同じ条件でインキュベートします。
コロニーは通常、シネコシスティスPCC 6803の7-14日後に、シネココッカス・エロンゲタスUTEX 2973の3〜7日後に現れる。コンジュガントを選択するには、熱無菌接種ロッドを使用して、膜から少なくとも2つの個々のコロニーを選択し、適切な抗生物質を含む新しいBG-11寒天プレートにストリークする。その後、シアノバクテリア培養物のストリークをLB培地5ミリリットルを含む15ミリリットル遠心分離管に接種し、振盪インキュベーターで一晩摂氏37度でインキュベートする。
明確な培養は、大腸菌汚染の存在を確認する。7日間の十分な成長期間に続いて、長期の凍結貯蔵またはその後の実験のための液体培養物を設定するために個々の無分類コロニーを選ぶ。本研究では、ゴールデンゲートアセンブリのワークフローが実証されました。
組立反応の変換後、大腸菌コロニーの標準の青色白色スクリーニングを使用して、成功したアセンブリを同定した。レベル1ベクトル及びエンドリンク1ベクトルにおけるeYFP発現カセットを、次にレベルTアクセプターベクターに組み立てて、ベクトルcpcBA-eYFPを与えた。組み立てられたcpcBA-eYFPベクターを制限消化により検証した。
cpcBA-eYFPまたはpPMQAK1-Tベクターの共役移動に成功すると、シネコシスティスPCC 6803およびシネココッカス・エロンガトゥスUTEX 2973の膜上で最大数百コロニーの成長をもたらした。強いPcpc560プロモーターに対して予想されるように、フローサイトメーターからのプレートリーダーおよびeYFP蛍光1細胞あたりのeYFP蛍光の正規化されたeYFP蛍光の値は陰性対照と比較して高かった。プレートリーダーとフローサイトメーターの両方を用いて、シネコシスス・エロンゲタスUTEX 2973では、シネコシスティスPCC 6803よりも蛍光値が高かった。
あなたが結合している株に応じて最小時間のインキュベートを確認してください。
