Siyanobakteriler giderek sentetik biyoloji ve yenilenebilir biyoteknoloji uygulamaları için yararlı platformlar olarak kabul edilmektedir fotosentetik mikropların önemli bir phylum vardır. Bu nedenle, heterolog DNA'nın farklı siyanobakteriyel türlere dönüştürülmesi, klonlama ve tanıtılması için sağlam teknikler geliştirmek önemlidir. Yani bu teknik, dna'yı doğal olarak dönüştürülebilen siyanobakteriyel türlere sokmak için konjugasyon veya üçlü eşleme adı verilen köklü bir yöntemi göstermektedir.
Konjugasyon, tek hücreden çok hücreli filamentöz türlere kadar çok çeşitli siyanobakteriyel suşlarda başarıyla gerçekleştirilmiştir. Bu tekniği ilk kez deniyorsanız, hem siyanobakteriyel hem de E.coli suşlarınızı özenle ele almaya özen gösteriyorsunuz. Örneğin, protokolde verilen değerlerin üzerinde santrifüj yapmayın ve girdap yapmayın.
Bakterileri ve Siyanobakterileri karıştırmak ilk kez kullananlar için garip görünebilir. Evlilik sürecini göstererek bunu açıklığa kavuşturmaya yardımcı olacağımızı umuyoruz. Birinci seviye montajların yapımından sonra, uygun düzeyde bir T acceptor vektörü seçin.
Son düzey bir derlemenin üç asal ucunu T düzeyi omurgasına bağlamak için uygun bir bitiş bağlantısı seçin. T düzeyinde bir veya daha fazla seviye bir derlemeleri monte etmek için, PBI1 ve gerekli bitiş bağlantı vektörü ile bir reaksiyon karışımı hazırlayın. Termal döngü programı ayarlayın ve el yazmasına göre devam edin.
İlk gün, Synechocystis PCC 6803 veya Synechococcus uzatır UTEX 2973 taze bir kültür kurarak siyanobakteriyel kültür büyümek. Bir ısı steril döngü ile, axenic BG-11 agar plaka hücreleri kazıyın ve 100 mililitre konik şişe içine taze BG-11 orta 50 mililitre ile dolu içine yerleştirin aşılamak için. Synechocystis PCC 6803 hücre kültürlerini 100 RPM'de 30 santigrat derecede büyütmek için şişeyi aydınlatmalı sallayarak bir kuluçka makinesine yerleştirin.
Synechococcus uzaması ulongatus UTEX 2973 için hücre kültürlerini 100 RPM'de 40 santigrat derecede büyütün. 1-2 gün sonra, hücre kültürünün bir mililitresini çizin ve spektrofotometreye ölçün. OD 750'deki absorbans 0,5 ila 1,5'e ulaşır.
İkinci gün, mililitre başına 100 mikrogram ve mililitre de kloramfenikol konsantrasyonu ile lb orta beş mililitre lb orta vektörleri içeren bir MC1061 E.coli yardımcı suşu aşılamak mililitre başına 25 mikrogram. Bir sallayarak kuvöz de 225 RPM gecede 37 derece santigrat büyümek. Daha sonra seviye T kargo vektörü taşıyan E.coli kültürü ile uygun antibiyotikler içeren LB orta beş mililitre aşılayın.
Bir sallayarak kuluçka 225 RPM gecede 37 derece santigrat kültür büyümek. Üçüncü gün, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 3, 000 g de yardımcı ve kargo E.coli gece kültürleri santrifüj. Hücre peletini bozmadan süpernatant'ı atın.
Antibiyotikler olmadan taze LB orta beş mililitre ekleyerek pelet yıkayın. Peleti yavaşça yukarı ve aşağı borulama ve supernatant kaldırmak için santrifüj ile askıya alın. Bu yıkama adımını bir gecede kültürden kalan antibiyotikleri çıkarmak için üç kez tekrarlayın.
Son yıkamadan sonra, hücre peletini ilk kültür hacminin LB orta hacminin yarısı kadar yeniden askıya alın. Daha sonra yardımcı zorlanma 450 mikrolitre iki mililitretüp kargo zorlanma 450 mikrolitre birleştirmek ve oda sıcaklığında bırakın. Daha sonra, 1, 500 g oda sıcaklığında 10 dakika siyanobakteriyel kültürün bir mililitre santrifüj ederek siyanobakteriyel kültürü hazırlamak.
Sonra hücre pelet rahatsız etmeden dikkatle supernatant atın. Aynı ilk hacimde taze BG-11 orta ekleyerek pelet dört kez yıkayın. Yıkanmış siyanobakteriyel kültürün 900 mikrolitresini iki mililitrelik bir tüpteki birleşik E.coli suşlarının 900 mikrolitresine ekleyin.
Kültürleri yavaşça yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın. Synechokisis PCC 6803 veya Synechococcus elongatus UTEX 2973 için iki saat oda sıcaklığında karışımı kuluçkaya yatırın. Karışımı oda sıcaklığında 10 dakika 1, 500 g'da santrifüj edin.
Supernatant 1.6 mililitre çıkarın ve kalan supernatant pelet resuspend. Antibiyotik olmadan bir LB BG-11 agar plaka üzerine bir 0.45 mikron membran filtre yerleştirin. Dikkatle steril bir yayıcı veya steril uçlu ile membran üzerinde E.coli / siyanobakteriyel kültür karışımı 200 mikrolitre yayılır.
Plakayı parafin filmle kapatın ve plakayı 24 saat boyunca ışıklı bir kuluçka makinesine yerleştirin. 24 saat sonra, dikkatle taze bir BG-11 agar plaka kargo vektörü için seçmek için uygun antibiyotikler içeren alev steril forseps kullanarak membran aktarın. Plakayı parafin filmile kapatın ve koloniler ortaya çıkana kadar daha önce olduğu gibi aynı koşullarda kuluçkaya yatın.
Koloniler genellikle Synechocystis PCC 6803 için 7-14 gün ve Synechococcus elongatus UTEX 2973 için 3-7 gün sonra görünür. Konjugatları seçmek için, bir ısı steril aşı çubuğu kullanarak, membran en az iki ayrı koloniler seçin ve uygun antibiyotik içeren yeni bir BG-11 agar plaka üzerine çizgi. Sonra bir cyanobakteriyel kültür bir çizgi bir 15 mililitre centrifuge tüp lb orta beş mililitre içeren ve 37 santigrat derece bir gecede 225 RPM bir sallayarak kuvöz de inkübatör bir çizgi aşılamak.
Temiz kültür E.coli kontaminasyonunun yokluğunu doğruluyor. Yedi günlük yeterli büyüme süresini takiben, uzun süreli kriyo depolama veya sonraki deneyler için sıvı kültürleri kurmak için tek tek axenik koloniler seçin. Bu çalışmada Golden Gate montaj iş akışı gösterilmiştir.
Montaj reaksiyonunun dönüşümünden sonra, E.coli kolonilerinin standart mavi beyaz taraması kullanılarak başarılı derlemeler tespit edildi. Düzey bir vektör ve bitiş bağlantısı bir vektör eYFP ifade kaseti daha sonra bir seviye T acceptor vektör içine vektör cpcBA-eYFP vermek için monte edildi. Monte cpcBA-eYFP vektör kısıtlama sindirim tarafından doğrulandı.
CPCBA-eYFP veya pPMQAK1-T vektörünün başarılı konjugal transferi Synechocystis PCC 6803 ve Synechococcus uzada UTEX 2973 için membran üzerinde birkaç yüz kolonilerin büyümesi ile sonuçlandı. Güçlü Pcpc560 organizatörü için beklendiği gibi, plaka okuyucu ve akış sitometre den hücre başına EYFP floresannormalleştirilmiş eYFP floresan için değerler negatif kontrol ile karşılaştırıldığında yüksekti. Hem plaka okuyucu hem de akış sitometresi ile floresan değerleri Synechococcus uzamış UTEX 2973'te Synechocystis PCC 6803'e göre daha yüksekti.
Hangi suşa göre minimum süre kuluçkaya yattığınızdan emin olun.
