Las cianobacterias son un importante phylum de microbios fotosintéticos que son cada vez más reconocidos como plataformas útiles para la biología sintética y aplicaciones de biotecnología renovable. Por lo tanto, es importante desarrollar técnicas sólidas para simplificar el diseño, la clonación y la introducción del ADN heterólogo en diferentes especies cianobacterianas. Así que esta técnica demuestra un método bien establecido llamado conjugación o apareamiento triparental para introducir ADN en especies cianobacterianas que no son naturalmente transformables.
La conjugación se ha realizado con éxito en una amplia gama de cepas cianobacterianas de una sola célula a especies filamentosas multicelulares. Si usted está intentando esta técnica por primera vez, por favor tenga cuidado de manejar tanto su cepa cianobacteriana y sus cepas de E.coli con cuidado. Por ejemplo, no centrifugar por encima de los valores indicados en el protocolo y no vórtice.
Mezclar bacterias y cianobacterias puede parecer extraño para los usuarios por primera vez. Esperamos que al demostrar el proceso de conjugación, ayudemos a aclarar esto. Después de la construcción de ensamblajes de nivel uno, elija un vector de aceptación T de nivel adecuado.
Elija un link final apropiado para ligar los tres extremos principales del conjunto de nivel final uno a la estructura básica del nivel T. Para ensamblar uno o más ensamblajes de nivel uno en el nivel T, prepare una mezcla de reacción con PBI1 y el vector de vínculo final requerido. Configure el programa de ciclor térmico y proceda de acuerdo con el manuscrito.
En el primer día, cultivar la cultura cianobacteriana mediante la creación de un nuevo cultivo de Synechocystis PCC 6803 o Synechococcus elongatus UTEX 2973. Con un lazo estéril térmico, raspa las células de la placa de agar BG-11 y colócalas en un matraz cónico de 100 mililitros lleno de 50 mililitros de medio fresco a inoculado. Coloque el matraz en una incubadora de agitación con iluminación para hacer crecer los cultivos celulares Synechocystis PCC 6803 a 30 grados centígrados a 100 RPM.
Para Synechococcus elongatus UTEX 2973, haga crecer los cultivos celulares a 40 grados celsius a 100 RPM. Después de uno o dos días, dibuje un mililitro del cultivo celular y mida un espectrofotómetro. La absorbancia en OD 750 alcanza 0,5 a 1,5.
En el segundo día, inocular una cepa auxiliar MC1061 E.coli que contenga vectores PRK24 y PRL528 en cinco mililitros de medio LB con ampicilina a una concentración de 100 microgramos por mililitro y cloramphenicol a una concentración de 25 microgramos por mililitro. Crecer a 37 grados centígrados durante la noche a 225 RPM en una incubadora de temblores. A continuación, inocular cinco mililitros de medio LB que contienen antibióticos apropiados con el cultivo de E.coli que lleva el vector de carga de nivel T.
Crecer el cultivo a 37 grados centígrados durante la noche a 225 RPM en una incubadora de temblores. En el tercer día, centrifugar el ayudante y la carga E. coli cultivos durante la noche a 3.000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante sin alterar el pellet celular.
Lave los pellets añadiendo cinco mililitros de medio LB fresco sin antibióticos. Resuspender el pellet pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo y centrifugar para eliminar el sobrenadante. Repita este paso de lavado tres veces para eliminar los antibióticos residuales del cultivo nocturno.
Después del último lavado, resuspender el pellet celular en la mitad del volumen de medio LB del volumen de cultivo inicial. A continuación, combine 450 microlitros de la cepa auxiliar con 450 microlitros de la cepa de carga en un tubo de dos mililitros y déjelos a temperatura ambiente. A continuación, preparar el cultivo cianobacteriano centrifugando un mililitro de cultivo cianobacteriano a 1.500 g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, deseche el sobrenadante cuidadosamente sin alterar el pellet celular. Lave el pellet cuatro veces añadiendo un medio BG-11 fresco del mismo volumen inicial. Añadir 900 microlitros del cultivo cianobacteriano lavado a 900 microlitros de las cepas combinadas de E.coli en un tubo de dos mililitros.
Mezcla las culturas entubando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos para Synechocystis PCC 6803 o dos horas para Synechococcus elongatus UTEX 2973. Centrifugar la mezcla a 1.500 g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Retire 1,6 mililitros del sobrenadante y resusppend el pellet en el sobrenadante restante. Coloque un filtro de membrana de 0,45 micras en una placa de agar LB BG-11 sin antibióticos. Extienda cuidadosamente 200 microlitros de la mezcla de cultivo E.coli/cianobacteriano en la membrana con un esparcidor estéril o una punta doblada estéril.
Selle la placa con película de parafina y coloque la placa en una incubadora iluminada durante 24 horas. Después de 24 horas, transfiera cuidadosamente la membrana utilizando fórceps esterilizados por llama a una placa de agar BG-11 fresca que contenga antibióticos apropiados para seleccionar para el vector de carga. Selle la placa con película de parafina e incubar en las mismas condiciones que anteriormente hasta que aparezcan las colonias.
Las colonias suelen aparecer después de 7-14 días para Synechocystis PCC 6803 y 3-7 días para Synechococcus elongatus UTEX 2973. Para seleccionar conjugantes, utilizando una varilla inoculante estéril térmica, seleccione al menos dos colonias individuales de la membrana y raya en una nueva placa de agar BG-11 que contenga antibióticos apropiados. Luego inocular una racha de cultivo cianobacteriano en un tubo centrífugo de 15 mililitros que contiene cinco mililitros de medio LB e incubar a 37 grados centígrados durante la noche a 225 RPM en una incubadora de temblores.
El cultivo claro confirma la ausencia de contaminación por E.coli. Después de un período de crecimiento suficiente de siete días, recoger colonias esxenicas individuales para establecer cultivos líquidos para el almacenamiento de criogénica a largo plazo o la experimentación posterior. En este estudio, se demostró el flujo de trabajo de ensamblaje de puerta dorada.
Tras la transformación de la reacción del ensamblaje, se identificaron ensamblajes exitosos utilizando el cribado blanco azul estándar de las colonias de E.coli. El casete de expresión eYFP en el vector de nivel uno y el enlace final de un vector se ensamblaron en un vector de aceptación T de nivel para dar al vector cpcBA-eYFP. El vector cpcBA-eYFP ensamblado se verificó mediante la digestión de restricción.
La transferencia conyugal exitosa de cpcBA-eYFP o el vector pPMQAK1-T dio lugar al crecimiento de hasta varios cientos de colonias en la membrana para Synechocystis PCC 6803 y Synechococcus elongatus UTEX 2973. Como se esperaba para el fuerte promotor Pcpc560, los valores de fluorescencia eYFP normalizada del lector de placas y fluorescencia eYFP por célula del citómetro de flujo eran altos en comparación con el control negativo. Con el lector de placas y el citómetro de flujo, los valores de fluorescencia fueron más altos en Synechococcus elongatus UTEX 2973 que en Synechocystis PCC 6803.
Asegúrese de incubar durante el tiempo mínimo según la cepa que esté conjugando.
